in vitro
Intervention de la tyrosinase
- une expérimentation très simple que les élèves conçoivent et réalisent avec deux objectifs : synthétiser in vitro des mélanines à partir de la tyrosine et montrer que cette synthèse nécessite l'intervention d'au moins une protéine.
- la démonstration par une étude cinétique de l'intervention d'un processus enzymatique dans la synthèse des mélanines.
Synthèse de mélanines in vitro
- Principe
Mettre en présence un petit volume d'une solution de tyrosine et quelques ml d'extait, dans l'eau, de chapeau d'un champignon de Paris. Préparer trois autres tubes de façon à montrer que la production de mélanines nécessite bien la présence de tyrosine mais aussi celle d'au moins un composant de l'extrait sensible à la chaleur.
- Résultats, commentaires
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Tubes
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Contenu
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Résultats
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1
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4,5 ml solution de tyrosine |
Pas de mélanines
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2
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4,5 ml extrait de champignon |
Pas de mélanines
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3
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1,5 ml sol. de tyrosine 3 ml extrait de champignon |
Mélanines surtout près de la surface
produit intermédiaire rouge-orangé |
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4
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1,5 ml sol. de tyrosine 3 ml extrait bouilli de champignon |
Pas de mélanines
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Si on prolonge l'expérimentation (24h environ), certaines mélanines noires insolubles (précipité) sédimentent, d'autres solubles et plus claires restent près de la surface (il doit s'agir de 2 types d'eumélanines).
Il y a ici une très légère coloration dans le tube 2 (sans tyrosine), elle est parfois plus marquée (en général quand les champignons sont "vieux").
La synthèse de mélanines à partir de la tyrosine nécessite l'intervention d'au moins un composé détruit par la chaleur.on pense à une protéine. Il doit s'agir d'une enzyme présente dans l'extrait de champignon: la tyrosinase.
Cette expérimentation suggère l'intervention d'un processus catalytique enzymatique (avec la tyrosinase) mais ne la démontre pas.
Rq/ Chez Agaric bisporus (champignon de Paris), les tyrosinases sont synthétisées dans le cytoplasme des cellules sous des formes inactives qui deviennent efficaces après rupture des parois. Si des substrats sont alors disponibles la synthèse peut démarrer sans apport exogène de tyrosine.
Etude cinétique du processus de synthèse des mélanines
Il ne s'agit pas ici d'étudier l'ensemble du processus mais seulement le début de la biosynthèse jusqu'à la formation de dopachrome, facile à caractériser par son maximum d'absorption (l = 475 nm). Les élèves réinvestissent les notions qu'ils ont acquises en enzymologie, ils doivent étudier, en colorimétrie, l'influence de la concentration en substrat sur la vitesse de la réaction enzymatique et construire la courbe Vi = f(S) , ce qui devrait leur permettre de caractériser l'intervention d'une catalyse enzymatique dans la synthèse de dopachrome.
- Principe
Préparer un extrait de champignon à partir de chapeaux de jeunes spécimens broyés dans l'eau. Réaliser les dilutions de tyrosine (S) dans l'eau.
Régler le colorimètre sur l = 475 nm. La cuve référence (blanc) contient 2 ml d'extrait + 1ml eau, les autres cuves 2ml d'extrait + 1ml de substrat à différentes concentrations. Les mesures d'absorbance sont ici faites manuellement. On peut utiliser un dispositif exao pour enregistrer en continu.
Rq/ Le contenu de la cuve référence peut se colorer, il ne faut pas que la "coloration parasite" soit importante car elle se produit dans chacune des cuves indépendamment de la concentration en tyrosine et même si elle influe de la même façon sur la mesure d'absorbance dans chaque cuve, il ne faut pat qu'elle intervienne de manière prépondérante. Avant chaque mesure, il faut bien mélanger par retournement.
- Résultats
- Suivi de la synthèse: influence de la concentration en substrat (Tyr)
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tubes
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[S] ua
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Abs (l = 455 nm)
au temps |
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0 min
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2 min
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3 min
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6 min
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10 min
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||
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1
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10
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0
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0,33
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0,39
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0,48
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0,52
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2
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5
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0
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0,31
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0,36
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0,37
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0,42
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3
|
2,5
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0
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0,29
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0,35
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0,38
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0,42
|
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4
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1,25
|
0
|
0,22
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0,31
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0,36
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0,41
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5
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0,62
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0
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0,10
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0,15
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0,17
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0,19
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- Courbe Vi = f(S)
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tubes
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[S] ua
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Vi ua
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1
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10
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33
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2
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5
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31
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3
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2,5
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29
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4
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1,25
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22
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5
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0,62
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10
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P = f(t) correspondante. On observe une assez grande dispersion des résultats suivant les groupes car l'efficacité de l'extrait est très variable, et les dilutions du substrat pas toujours bien réalisées.
Cependant, une courbe Vi = f(S) comme celle qui est proposée ici montre que la synthèse de dopachrome fait intervenir un processus catalytique qui met en jeu la formation de complexes enzyme- tyrosine ( notion développée et acquise en enzymologie).
Rq/ Une fois l'interprétation formulée, on peut confirmer que l'étude cinétique concernait bien l'intervention de la tyrosinase en fournissant la chaîne de réactions qui conduit de la tyrosine à la dopachrome.
Action du peroxyde d'hydrogène sur la synthèse de mélanines "catalysée" par l'extrait de champignon
Les données fournies initialement indiquent que dans le follicule pileux la présence, dans l'environnement des mélanocytes, de H2O2, entraîne l'inactivité de la tyrosinase et bloque la synthèse des mélanines.
L'action de
H2O2 sur la synthèse in vitro de la mélanine dans l'extrait de champignon peut être testée.
L'ajout de 2 gouttes d'eau oxygénée au contenu d'un tube (2ml extrait + 1ml tyrosinase) provoque un dégagement gazeux bien visible (tube de droite) et accélère la synthèse de mélanines qui a lieu dans l'ensemble du contenu du tube et non plus seulement près de la surface (même tube, à gauche).
On n'obtient pas le résultat prévu.
Le gaz produit est O2, il provient de l'oxydation du peroxyde d'hydrogène et sature la solution. Ainsi, O2 n'est plus limitant dans l'ensemble du milieu réactionnel ce qui permet une action plus efficace de la tyrosinase. L'extrait de champignon doit contenir une catalase.
