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-Intérêts pédagogiques -Motivation -Etude expérimentale (EXAO) Principe, matériel, manipulation Résultats |
-Représentations moléculaires en 3D Avec Protein Comparator Avec Rasmol |
Niveau :Ts spécialité
Intérêts pédagogiques: l'exemple de la tacrine permet de comprendre comment la connaissance des aspects biochimiques du fonctionnement nerveux peut induire des applications médicales.La manipulation (EXAO) nécessite un réinvestissement des notions d'enzymologie acquises en 1èreS, elle sera complétée par une recherche d'informations sur Internet et le traitement de certains fichiers soit directement soit après téléchargement.
Motivation: partir d'un extrait d'article du Panorama du Médecin (voir ci-dessous) ou de la Recherche( Nov 97) ou du mensuel médical Actualités Innovations-Médecine (Nov 95 ,Mars 98)...L'extrait doit fournir les informations nécessaires pour comprendre le protocole expérimental et orienter les recherches sur Internet.
"Les différentes approches thérapeutiques de la maladie d'Alzheimer destinées à compenser le déficit cholinergique retrouvé dans cette pathologie reposent sur l'augmentation de la production présynaptique du neurotransmetteur manquant.Les approches actuelles reposent sur les anticholinestérasiques...La molécule qui a bénéficié des études les plus nombreuses est la tacrine...Il semble ,aujourd'hui qu'elle offre un bénéfice significatif chez les sujets présentant une atteinte légère à modérée pour un tiers à la moitié des malades" Dr Rose Marie Castello (Panorama du médecin n°4100).
Les élèves doivent donc proposer un modèle moléculaire du mode d'action de la tacrine qui permet de rendre compte de son utilisation dans le traitement de la maladie d'Alzheimer.Ce modèle doit intégrer les résultats expérimentaux .
Connaissances indispensables : la réaction catalysée dans la fente synaptique par l'AchE permet une hydrolyse rapide du neurotansmetteur Acétylcholine en choline et acide éthanoïque.
Principe de l'expérimentation : établir la cinétique de la réaction catalysée par l'acétylcholinestérase (AchE) en absence et en présence de tacrine.On suit la formation des produits par l'intermédiaire d'un indicateur de pH le méta-nitrophénol, jaune, qui se décolore ici en présence d'acide éthanoïque .La forme colorée absorbe fortement les radiations de longueur d'onde comprises entre 400 et 440 nm.Il suffit donc de suivre la baisse d'absorbance à 425 nm.
Matériel et produits nécessaires :
- Matériel/ groupe : spectrophotocolorimètre ou colorimètre + cuves ,adaptateur voltmètre, interface, ordinateur, logiciel Enzymo, pipette 5ml , micropipette.
-Produits: acétylcholinestérase (Sigma) 500 unités dans 2 ml d'eau, m-nitrophénol 0,75g/l dans tampon phosphate pH =7,8 (Sigma), acétylcholine chlorure (Sigma),tacrine (Sigma)
Manipulation :
Faire le 0 d'absorbance sur de l'eau puis préparer une cuve avec1 ml de m-nitrophénol +0,3ml de chlorure d'acétylcholine+1,5 ml d'eau.Ajouter 60µl d'enzyme ,mélanger puis lancer l'enregistrement de P= f'(t) avec t=60min.Suivre la baisse de l'absorbance( elle doit être inférieure à 1 à t0.Recommencer en ajoutant une une très petite quantité de tacrine au milieu réactionnel.
Résultats
L'expérimentation montre bien que la tacrine est un inhibiteur de l'acétylcholinestérase.Pour mieux comprendre son action , il est intéressant de compléter l'étude par l'exploitation de représentations moléculaires en 3D.
Objectifs : compléter l'étude expérimentale par une recherche sur Internet débouchant sur une modélisation en 3D permettant de comparer les complexes AchE-acétylcholine et AchE -tacrine.
La recherche des fichiers intéressants :
Des fichiers exploitables sont disponibles à Protein Data Bank (Brookaven, Etats-Unis) .ILs peuvent être téléchargés.Pour accéder au fichier 2ACE qui permet de reconstituer le modèle du complexe AchE- acétylcholine il est intéressant de passer par la page de présentation à l'adresse suivante http://www.pdb.bnl.gov/pdb-bin/opdbshort?oPDBid=2ace
Elle permet en plus l'accès à des renseignements sur les acides aminés en contact avec l'AchE.
De la même façon, on peut accéder au fichier 1ACJ qui permet de voir la tacrine associée à l'AchE http://www.pdb.bnl.gov/pdb-bin/opdbshort?oPDBid=1acj
Le traitement des fichiers :
Chaque fichier peut être traité en direct avec le plugin CHIME , l'ensemble PROTEIN COMPARATOR + CHIME permet de travailler avec les 2 modèles moléculaires (les 2 complexes Enz-ligand) dans la même page.Les fichiers téléchargés peuvent être traités, hors connexion, de la même façon ou avec le logiciel RASMOL.
CHIME, PROTEIN EXPLORER et COMPARATOR, RASMOL peuvent être téléchargés par l'intermédiaire du site de l'INRP.
Il peut être intéressant de faire apparaître dans un premier temps les 2 molécules avec COMPARATOR puis d'approfondir l'étude avec RASMOL plus facile à utiliser.Cela conduit à mettre en évidence les acides aminés qui établissent des contacts avec l'acétylcholine puis à situer la tacrine par rapport à eux.
Résultats :
-images 3D des complexes obtenues avec PROTEIN COMPARATOR (l'acétylcholine n'a pas été cristallisée avec l'enzyme, elle a été positionnée secondairement)
-images 3D obtenues avec RASMOL
- complément: images 3D des molécules d'acétylcholine et de tacrine (RASMOL)
Les modèles obtenus permettent de bien comprendre les résultats expérimentaux et de construire un schéma qui explique le mode d'action du médicament dans la fente synaptique.
Conception de l'expérimentation : Auclair Jean Jacques
