Un réacteur à saccharase
immobilisée
La saccharase de levure immobilisée est utilisée dans certaines biotechnologies alimentaires ou pharmaceutiques pour préparer le sucre inverti, mélange équimolaire de glucose et fructose. Les élèves ont obtenu des renseignements concernant ces biotechnologies sur internet .Ils ont , dans une séance précédente de TP, extrait et caractérisé la saccharase de la levure saccharomyces cerevisiae.
Objectifs
Il s'agit de réaliser un réacteur simple à saccharase
immobilisée dans l'alginate et de vérifier son efficacité.
La manipulation permet un réinvestissement des acquis d'enzymologie.
Principe
Le protocole est inspiré de celui que propose D .Loncle dans
son ouvrage Génie enzymatique Ed Douin. L'enzyme de saccharomyces
est immobilisée dans une matrice d'alginate, polyoside qui forme un
gel (billes) en présence de Ca 2+ .On fait passer le substrat (saccharose)
dans la colonne qui contient l'enzyme .On teste l'efficacité de la
saccharase fixée par le dosage du glucose recueilli .La quantité de
glucose dans chaque fraction est ici évaluée par une double
réaction enzymatique(glucose oxydase+peroxydase)dont on enregistre
la cinétique en EXAO.
-Alginate de sodium (Sigma) préparé à 2% et dégazé, solution de chlorure de calcium 0,15M, test glucose avec oxydase + peroxydase + chromogène, tampon acétate ph= 4,7 (optimal pour la saccharase), solution d'invertase de saccharomyces à raison d'un peu de poudre (Sigma) dans 5 ml de tampon acétate.
-Seringue de 2ml pour placer les billes d'alginate + saccharase, une autre seringue de 10ml qui sert de réservoir pour le substrat et dont on règle le débit par un robinet, cuves et spectrophotocolorimètre réglé sur 505 nm, logiciel Enzymo (Jeulin), chaîne EXAO.
Expérimentation
-Immobilisation de l'enzyme, préparation des billes d'alginate: bien
mélanger dans un tube à hémolyse 0,5 ml de la solution d'enzyme
avec 2,5 ml d'alginate à 2%,verser l'ensemble dans une seringue placée
10 cm au-dessus d'un bécher contenant 100ml de solution de chlorure de
calcium. Chaque fois qu'une goutte d'alginate tombe dans le chlorure de calcium,
elle se gélifie et forme une bille. On peut ainsi obtenir une vingtaine
de billes.
Montage du dispositif et déroulement de l'expérience: placer les billes dans la seringue-réacteur, remplir le réservoir de substrat, régler la vitesse d'écoulement (débit constant), récupérer dans une cuve de spectro 2,5ml de solution après passage au contact des billes. Remplir ainsi plusieurs cuves les unes après les autres. Dans chaque cuve, ajouter 0.5 ml du réactif glucose (glucose oxydase + peroxydase + chromogène) puis suivre la cinétique de la double réaction enzymatique à l'aide de la chaîne EXAO et du logiciel Enzymo. Constater la coloration bien nette dans chaque cuve sortie du spectro.
