Cristaux de Lysozyme (technique du hanging drop)

Sommaire - Objectifs - Informations - Principe - Matériel - Expérience - Résultats - Etude en 3D

Objectifs : Proposer une expérimentation qui motive une recherche fructueuse sur Internet débouchant sur l'étude en 3D du complexe enzyme-substrat (à l'aide de Rasmol ou Chime).

Pourquoi choisir le lysozyme?

• Le lysozyme du blanc d'œuf a été mis en évidence par électrophorèse dans une manipulation antérieure
• Le lysozyme est la première enzyme analysée à haute résolution par cristallographie aux RX. Il a pu être cristallisé avec un faux substrat en place, tri-NAG (inhibiteur compétitif), ce qui a permis de déterminer la structure en 3D du complexe lysozyme du blanc d'œuf-tri-NAG en place dans le site actif. Le fichier 1hew.pdb permet de visualiser le complexe directement sur internet avec chime ou après rapatriement avec Rasmol.

Quelques informations concernant le lysozyme (fournies aux élèves).

Le lysozyme est une protéine dont les propriétés enzymatiques ont été découvertes par Flemming en 1922. En effet, alors qu'il avait le rhume, il fit tomber un peu de mucus nasal dans une culture de bactéries. Il constata que les bactéries avaient été dissoutes au contact du mucus. La substance active fut appelée lysozyme et son activité fut étudiée par la suite sur des bactéries très sensibles Micrococcus lysodeikticus. On montra que le substrat de l'enzyme est le constituant de la paroi de certaines bactéries: un polymère glucidique constitué par la répétition du motif NAG-NAM. Le lysozyme catalyse la coupure des liaisons entre NAM et NAG, ce qui désorganise complètement le constituant de la paroi et provoque la lyse des bactéries.

Le lysozyme est en réalité très répandu, chez les végétaux, chez les animaux ( blanc d'œuf), chez l'homme (mucus, larmes, salive).

Principe de l'expérimentation.

Suivre en turbidimétrie la disparition de bactéries en présence de l'enzyme.

Matériel et produits nécessaires:

Spectrophotocolorimètre (réglé sur 450nm), ou colorimètre ( filtre bleu) ,cuves.

Tampon phosphate à pH=6,2 (100ml dihydrogénophosphate de potassium 0,066M ,ajusté à

Ph 6,4 avec KOH 1M).

Lysozyme de blanc d'œuf (Sigma)

Microccocus lysodeikticus (Sigma)

Seringues 1ml ,tubes

Logiciel ENZYMO , ordinateur, interface, adaptateur voltmètre: dispositif classique pour EXAO en colorimétrie.

Expérimentation réalisée par les élèves (1èreS,première partie de la séance: 45 min)

-Vérification du montage

-Module ABSORBANCE, durée 2min

-Préparations :

Cuve "blanc": 3ml de tampon .Régler le zéro d'absorbance.

Solution d'enzyme une pointe d'aiguille lancéolée de lysozyme dans 2ml de tampon (pour plusieurs groupes).Prélever 0,5ml avec une seringue.

Suspension de Microccocus :dans 10ml de tampon , une pointe de poudre (bactéries lyophilisées) .La suspension doit être bien homogène . Verser 3 ml de la suspension de Micrococcus dans une cuve, vérifier contre le "blanc" l'absorbance qui ne doit pas dépasser 1.

-Enregistrement :ajouter aux 3 ml de la suspension de bactéries 0,1ml de la solution d'enzyme, mélanger par retournement et placer rapidement et correctement la cuve dans le colorimètre. Lancer l'enregistrement.

Les élèves doivent penser à réaliser un enregistrement témoin (superposition).

RQ: Il serait intéressant de réaliser un essai avec tri-NAG mais ce produit est trop onéreux.

Résultats:

X1000	X 1000
Micrococcus après action du lysozyme à t=2min.Coloration : bleu de méthylène.	Micrococcus témoin à t=2min. Coloration : bleu de méthylène.

Etude en 3D du complexe lysozyme- tri-NAG.(deuxième partie de la séance : 45mn)

• Recherche sur Internet: page Atlas for 1hew ( hen egg white). Cette page permet d'une part de télécharger le fichier 1hew.pdb pour l'utiliser ensuite avec Rasmol , d'autre part, de lancer chime pour une étude directe en 3D.
• Cliquer pour obtenir la page Atlas for 1hew
• Pour une étude avec Rasmol, voir JL. Fargues
• L'utilisation de chime nécessite son téléchargement.

 

Conception de la manipulation : AUCLAIR Jean Jacques