1ère S4 (option Sciences expérimentales)

   Culture de levures dans un fermenteur

A) Introduction

Les levures sont considérées comme un aliment de grande valeur nutritive. Pour cette raison, la production de "levure-aliment" s'effectue sur des milieux très variés dont le lactosérum, produit résiduaire des fromageries. C'est un excellent milieu de culture permettant le développement de levures utilisant le lactose comme source de carbone. Ce sont des souches de kluyveromyces fragilis et lactis (groupe des saccharomyces), qui, cultivées dans des conditions optimales ont le meilleur rendement. Ces cultures ont lieu à la laiterie Bel dans de grands fermenteurs dont le volume peut atteindre plusieurs centaines de litres. Elles sont réalisées en très grandes quantités puisque l'objectif est d'obtenir le meilleur rendement possible.

   


B) Objectif

Utiliser un fermenteur (de petite taille) pour réaliser une culture de levures (ici saccharomyces cerevisiae) en essayant d'obtenir le meilleur rendement possible.
Suivre l'évolution du nombre d'organismes, celle de la concentration en nutriment (glucose), et celle de la concentration en produit fabriqué.

C) Principe

La levure saccharomyces utilise la respiration pour oxyder le glucose, elle extrait ainsi 40% de l'énergie contenue dans ce métabolite. Grâce à cette énergie, elle réalisera ses travaux cellulaires et se reproduira par bourgeonnement. Mais elle utilise aussi la fermentation alcoolique qui, elle, n'extrait qu'environ 2% de l'énergie du métabolite. La fermentation alcoolique est une dégradation très incomplète du glucose puisqu'elle produit en plus du dioxyde de carbone, un résidu organique qui contient de l'énergie potentielle : l'éthanol. L'équation de l'oxydation incomplète du glucose au cours de la fermentation alcoolique (bilan) est:
C6H12O6(glucose) --> 2CO2 + 2 C2H5OH(éthanol) + Energie

Dans cette expérience, on cultive des levures saccharomyces dans un fermenteur en suivant le même principe que celui utilisé par la laiterie Bel donc en aérobiose.On suit l'évolution du taux de glucose consommé, celle du taux d'éthanol produit, la croissance des levures.

Principe du fermenteur Bel.


D) Protocole expérimental

Matériel nécessaire :
-Une préculture de levures saccharomyces
-Un fermenteur avec une sonde thermique et un thermostat, un aérateur d'aquarium qui permet l'aération du milieu et son brassage.
-Une sonde à éthanol (reliée à un dispositif expérimental assisté par ordinateur) et une solution étalon à 0,8g/l.
-Un test colorimétrique permettant de doser le glucose par une méthode enzymatique : réactif du Glucose = glucose oxydase + peroxydase + chromogène et solution de glucose étalon à 1g/l.
-Un spectrophotocolorimètre (et des cuves)
-Tubes à essais
-Pipettes et micropipettes.

Notre dispositif expérimental


Expérience :
Introduire dans le fermenteur (cf schéma ci-dessus) une préculture de levures dans 1,8l de milieu nutritif (liquide). Il contient les nutriments nécessaires au développement des levures dont le glucose. Le pH choisi (pH = 5) est optimal pour le développement des levures et trop bas pour permettre un développement de bactéries ; on l'obtient en introduisant de l'acide sulfurique dans le fermenteur, de même, la température de 26°C est optimale.

Au début de l'expérience (t = 0min.), effectuer les mesures suivantes par prélèvements (ils sont facilement réalisables grâce à un système utilisant des seringues) :
Evaluation du nombre de cellules :
Après avoir fait le zéro d'absorbance sur le milieu nutritif (sans levures), mesurer l'absorbance à 600nm de manière à pouvoir déterminer le nombre d'organismes grâce à la courbe d'étalonnage obtenue par la méthode des dilutions à l'aide d'une cellule de Malassez.

Dosage du glucose :
-Solution étalon :
Introduire dans un tube 20µl d'une solution de glucose à 1g/l et 2ml de réactif (du glucose).
Attendre pendant 10min.Mesurer l'absorbance ( = 505nm car à cette longueur d'onde, les rayons lumineux sont parfaitement absorbés par le chromogène coloré (contenu dans le réactif) ).
-Dosage du glucose dans le fermenteur
Introduire dans un tube 20µl de solution prélevée dans le fermenteur et 2ml de réactif, bien mélanger.
Attendre 10min.
Mesurer l'absorbance ( = 505nm)


Dosage de l'éthanol
Après avoir réglé la sonde avec une solution d'éthanol à 0,8g/l, on l'introduit pendant 2 mn dans la solution prélevée.

Refaire les mêmes manipulations (sauf celle avec le témoin glucose) pour chaque prélèvement.

 

E) Résultats
Nombre de cellules

On utilise la courbe d'étalonnage réalisée au cours d'une séance précédente. Elle permet d'établir qu'une unité d'absorbance (UA) correspond à environ 17500 cellules.

 

1 unité d'absorbance = 17500 cellules

 

 


Taux de glucose
Pour déterminer la concentration en glucose de la solution prélevée, on utilise la mesure obtenue avec la solution étalon soit pour Glucose 1g/l : A 505 = 0,46
On déduit ainsi la concentration en glucose de la solution prélevée dans le fermenteur pour une absorbance donnée.


Taux d'éthanol exprimé en unité arbitraire

tableau de résultats

 Temps en min

 A600 dilution au 1/2

Nombre de cellules /µl 

 A505

 Glucose en g/l

Ethanol en ua 

 0

50

145

270

320

420

480

1380

 0,295

0,329

0,357

0,440

0,419

0,479

0,490

0,634

 

 

 10325

11515

12495

15400

14665

17004

17150

22190

 0,776

0,610

0,625

0,453

0,330

0,229

0,104

0,01

 1,68

1,32

1,35

0,98

0,71

0,49

0,22

0,00

 

0,14

0,18

0,39

0,47

0,84

1,02

0,15

A partir du tableau, on trace les courbes suivantes :



Evolution de la biomasse cellulaire /µl et des taux de glucose et d'éthanol en fonction du temps

 

F) Interprétations

Les levures ont utilisé la respiration pour oxyder le glucose, mais aussi la fermentation (puisqu'il y a production d'éthanol).
-De t = 0min à t = 1590min : la courbe représentant l'évolution du nombre de cellules, traduit une augmentation du nombre de levures/µl (il a été multiplié par environ 2,2).

-De t= 0min à t= 600 min :
La courbe représentant l'évolution du taux de glucose consommé traduit une diminution jusqu'à disparition complète du glucose (t= 600min).
La courbe représentant l'évolution du taux d'éthanol produit, traduit une augmentation de ce taux (jusqu'à environ une u.a).
-De t= 600min à t= 1500min, il n'y a plus de glucose, et la courbe représentant l'évolution du taux d'éthanol, traduit une diminution de ce taux (au même moment.).
On peut donc penser que les levures ont utilisé l'éthanol (qui représentait encore de l'énergie), pour en extraire l'énergie et se reproduire.

Critique : certaines mesures d'absorbance n'ont pas été correctement réalisées.

G) Conclusion
En connaissant les conditions de développement optimales des levures, nous avons pu les cultiver efficacement (rendement correct : en 26 heures leur nombre a été multiplié par 2,7).A la fin de l'expérience, de nombreuses levures étaient en bourgeonnement.

X 1000

 

L'expérimentation a commencé le vendredi à 9h 30 avec une classe, elle a continué l'après-midi avec une autre classe, la dernière mesure a été réalisée le lendemain matin.Une discussion a permis d'approfondir les interprétations et a conduit à proposer des modifications du protocole afin d'obtenir un meilleur rendement.

Auclair Jean Jacques, professeur de SVT