La LDH Lactate Deshydrogénase enzyme de la fermentation lactique

Objectifs:
-Vérifier expérimentalement que la LDH musculaire, enzyme-clé de la fermentation lactique catalyse la réduction du pyruvate en présence de NADH (Tred) et que la réaction régénère le coenzyme sous sa forme oxydée NAD⁺ (Tox), cette régénération étant indispensable pour la glycolyse donc pour la production d'ATP en anaérobiose.
-Compléter l'étude expérimentale par une recherche sur internet qui doit permettre d'une part d'identifier l'enzyme de la glycolyse qui utilise le NAD⁺ et d'autre part de télécharger les fichiers nécessaires pour une étude en 3D des enzymes afin de comprendre comment l'action de la LDH conditionne le déroulement de la glycolyse. 
-Réaliser une électrophorèse permettant de vérifier la présence de LDH dans l'extrait de fibres musculaires de crabe utilisé pour l'expérimentation.

Cette étude permet de suivre en continu une réaction d'oxydoréduction impliquée dans le métabolisme énergétique. Sur le plan méthodologique, l'élaboration du protocole permet un réinvestissement des acquis d'enzymologie. Sur le plan pratique, il s'agit d'utiliser des techniques déjà expérimentées (colorimétrie en EXAO, électrophorèse, modélisation moléculaire en 3D) avec quelques nouveautés.

Place de l'expérimentation dans la progression de 1^èreS:
La manipulation peut prendre place dans le chapitre "Quelques aspects du métabolisme énergétique" ou dans le thème optionnel "Quelques aspects de la physiologie appliquée à l'activité sportive".C'est dans le cadre de l'enseignement optionnel que l'étude a été réalisée avec les élèves, elle a porté sur 2 séances.

Le travail des élèves et l'organisation des séances:
Exao 
-Recherche du principe de l'expérimentation, exploitation des spectres d'absorption du NAD⁺ et du NADH pour choisir la longueur d'onde qui va permettre de suivre la cinétique de la réaction étudiée.

NADH absorbe fortement à 340 nm, NAD⁺ n'absorbe pas: on peut donc suivre l'oxydation du NADH à 340nm par la baisse de l'absorbance. 
-Extraction de la LDH des fibres musculaires de crabe: dans un mortier, récupérer les muscles de 2 pattes dans 20ml de tampon phosphate pH=7,4 puis couper en petits morceaux, broyer, filtrer.
-Réalisation de l'expérimentation: intégrer le spectro dans le dispositif d'Exao, sélectionner la longueur d'onde 340nm puis dans le logiciel Enzymo (JEULIN) choisir le module absorbance. Préparer le milieu réactionnel en plaçant dans une cuve de spectro 2,5ml de tampon phosphate + 0,1 ml de pyruvate de sodium à 21mmoles par litre + 0,1ml d'extrait de muscle. Faire le 0 d'absorbance sur cette cuve de référence puis ajouter 0,1ml de NADH (à 2,5 mmoles par litre). Mélanger et placer la cuve dans la loge de lecture du spectro. Lancer le plus vite possible l'enregistrement. Si la réaction est trop rapide, modifier les conditions .

Recherche sur internet et travail sur les modèles moléculaires
 Pendant que 2 groupes (2 montages Exao) réalisent l'expérimentation, les autres recherchent sur internet l'enzyme de la glycolyse qui utilise le NAD⁺ en consultant par exemple un site académique. Ils recherchent ensuite les fichiers qui permettent une étude en 3D d'une part de cette enzyme, la Glycéradéhyde 3 Phosphate Déshydrogénase (G3PDH) et d'autre part de la LDH. Ces fichiers sont disponibles au site The RCSB Protein Data Bank, ils peuvent être exploités directement sur internet à condition de posséder le plugin Chime ou bien téléchargés et utilisés sur site par l'intermédiaire de Chime ou Rasmol.
 Le choix des fichiers est délicat , 3 ont été retenus:
-LDH de muscle de porc avec 2 chaînes (sur 4 normalement présentes dans la molécule), NADH en place ainsi qu'acide oxamique (ref du fichier pdb: 9LDB).
-LDH de muscle de poisson avec 1 seule chaîne, NADH en place ainsi que le pyruvate ( ref 3LDH).
-G3PDH de muscle d'homme avec 2 chaînes (sur 4 normalement présentes) avec NAD en place (ref 3GPD).
L'étude des modèles montre que l'acide oxamique(oxamate) peut occuper le site actif de la LDH à la place du pyruvate, cela motive une expérience complémentaire.

Electrophorèse
Elle est réalisée à la séance suivante à partir d'un extrait frais de muscles de crabe, sur un gel .La révélation de la LDH est spécifique car elle se fait par l'intermédiaire d'une réaction enzymatique colorée. Les réactifs sont étalés sur le gel. Pendant la migration, les élèves poursuivent l'étude en 3D des molécules. Ici l'extraction est très grossière et on ne met pas en évidence les isoenzymes de la LDH.

Résultats et commentaires:
-Mise en évidence de l'action de la LDH: les courbes obtenues montrent bien qu'en présence de pyruvate, la LDH extraite du muscle oxyde le NADH en NAD⁺ .C'est bien la LDH présente dans l'extrait qui intervient car en présence d'acide oxamique en faible quantité l'oxydation du NADH est plus lente, il se forme des complexes LDH-acide oxamique qui ralentissent la réaction (inhibition compétitive) car  l'acide oxamique prend la place du substrat dans le site actif de l'enzyme .Cette interprétation est argumentée par l'étude comparative en 3D des complexes LDH-substrat et LDH-inhibiteur.

-L'électrophorégramme confirme la présence de LDH dans l'extrait de muscles

-L'étude des modèles moléculaires montre bien que la LDH et la G3PDH fixent chacune le coenzyme, l'action de l'une étant  in situ conditionnée par celle de l'autre. Des études plus précises semblent indiquer que les 2 enzymes peuvent s'échanger directement le coenzyme sans qu'il soit vraiment libéré.

Les élèves peuvent, à partir de l'ensemble des informations recueillies, réaliser un schéma qui met en évidence l'intervention complémentaire des 2 enzymes dans la fermentation lactique.

Le logiciel Rasmol v2-6 -ucb utilisé ici est mis gracieusement à la disposition de la communauté scientifique par son auteur Roger Sayle, il en est de même pour le plugin Chime dont l'auteur est Eric Martz (University of Massachusetts).Pour télécharger ces outils on peut passer par le site de l'Inrp.

Expérimentation réalisée par les élèves de 1^ère S1 avec leur professeur Monsieur Auclair Jean Jacques.