SACCHARASE

Cinétique indirectement établie en oxymétrie

Objectif
Etablir la cinétique de la réaction catalysée par la saccharase sécrétée par Saccharomyces cer., indirectement, en oxymétrie, puis étudier l'influence de la concentration du substrat (saccharose) sur la vitesse initiale de la réaction.

Principe
L'hydrolyse enzymatique du saccharose libère du glucose. La cinétique de formation du glucose peut être indirectement suivie par l'intermédiaire d'une seconde réaction catalysée par la glucose oxydase qui reprend le glucose et l'oxyde avec "consommation" d'O₂. L'enregistrement (exao) de l'évolution de la concentration du dioxygène dissous dans le milieu réactionnel en fonction du temps représente donc de manière satisfaisante la cinétique de la réaction catalysée par la saccharase, à condition d'une part que la glucose oxydase et O₂ ne soient pas limitants et que d'autre part, le glucose a formé soit très rapidement transformé (mutarotase) en b glucose, seule forme utilisée par la glucose oxydase. L'enregistrement peut être considéré comme fiable dans sa partie initiale (Vi) quand la concentration en O₂ est encore relativement élevée. Il est d'autre part indispensable de vérifier que O₂ n'est pas consommé par des cellules de levure éventuellement présentes dans l'extrait (test respiration).

Validation du protocole
-Extrait enzymatique (saccharase): 20ml eau + 2g de levure, laisser reposer 20 min , filtrer , centrifuger, vérifier au microscope l'absence de cellules.
-Milieu réactionnel: 5ml de solution saccharose 0,1 mole/l + 0,5 ml de sol. de glucose oxydase + mutarotase (à raison d'un peu de poudre de chaque enzyme dans 2ml d'eau ).
-Enregistrement: placer le milieu réactionnel dans le bioréacteur, disposer l'oxymètre, agiter puis lancer l'enregistrement. A t = 1min, introduire 0,5 ml d'extrait.
Réaliser un autre enregistrement, dans les mêmes conditions (même vol. final) mais sans ajouter le mélange glucose oxydase + mutarotase: c'est le test respiration.

Résultats

Protocole appliqué à l'étude Vi = f(S)
Appliquer le protocole validé ci-dessus, faire varier à chaque fois la concentration en saccharose sans modifier les autres paramètres.

Résultats