Saccharase

Mécanisme de la catalyse

Il s'agit de proposer un modèle fonctionnel qui explique l'intervention de la saccharase dans l'hydrolyse du saccharose et qui soit en cohérence avec l'ensemble des informations tirées de l'exploitation du modèle moléculaire, de l'alignement des séquences, des résultats des expériences de marquage d'affinité et de mutagenèse dirigée. Voir animation flash (indispensable).
Un dizaine de résidus ac. aminés particite à la stabilisation du complexe saccharase-saccharose
Ces ac.aminés délimitent le site actif, des interactions (en particulier des liaisons hydrogène) entre certains de leurs atomes et le saccharose s'établissent ce qui permet de placer le substrat dans une position particulièrement favorable à l'intervention de l'enzyme.
Un mécanisme réactionnel en 2 temps (Voir animation flash)
- Formation d'un intermédiaire covalent Enz-fructosyl avec libération de glucose
Le processus est initié par une attaque nucléophile du carboxyle déprotoné de Asp23 (17) sur le C2 de la moitié fructose. Il en résulte la rupture de la liaison osidique dans laquelle était engagé le C2, et la capture par l'O de cette liaison d'un proton libéré par Glu204 (190).Une molécule de glucose est alors libérée et un composé Enz-fructosyl est constitué par l'intermédiaire de Asp23.
- Intervention d'eau, libération du fructose, retour à l'état initial de l'enzyme
Glu204 qui s'est comporté comme un acide dans la première étape agit maintenant comme une base en captant un proton de H₂O, l'hydroxyle restant est fixé par le C2 du fructosyl ce qui s'accompagne de la rupture de la liaison entre ce C2 et Asp23. Une molécule de fructose est libérée et l'enzyme retrouve son état initial. Un nouveau cycle catalytique peut commencer.

Pour que le mécanisme de catalyse proposé soit crédible, il faut que dans l'enzyme "au repos", d'une part le carboxyle de la chaîne latérale de Asp23 soit déprotoné et d'autre part celui de Glu204 soit protoné. Les pKa de ces carboxyles sont assez voisins du moins pour les ac.aminés libres (3,9 pourAsp et 4,3 pour Glu). Dans les conditions de pH qui conviennent à la saccharase (pH optimal 4,7 mais activité encore importante à pH 7) on conçoit que Asp soit déprotoné mais la logique conduit à envisager que Glu l'est aussi, et dans ce cas il ne peut se comporter comme un donneur de proton. L'exemple d'autres d'hydrolases (lysozyme...) a montré que le pKa de certains résidus Glu peut dans l'environnement d'une protéine différer de manière significative de celui qui est mesuré avec l'ac. aminé libre. On pense que dans la saccharase, le pKa de Glu204 pourrait atteindre 6,8 le résidu voisin Cys205 (conservé) participant alors à l'affaiblissement de son acidité. Ces considérations permettent de valider le modèle.