SACCHARASE

Quelques données pour établir le mécanisme de la catalyse
La compréhension du mécanisme d'action de l'enzyme passe par l'exploitation de données fournies par le modèle moléculaire en 3D mais aussi par l'interprétation de résultats obtenus avec d'autres méthodes d'approche.

Des acides aminés conservés
L'alignement des séquences des saccharases synthétisées par différentes espèces (voir résultat) révèle les ac. aminés invariants parmi lesquels figurent 9 des 11 résidus d' ac.aminés que l'étude du modèle moléculaire a permis de retenir comme probables intervenants dans la mise en place d'interactions entre l'enzyme et le substrat. La sélection naturelle les a conservés car ils doivent être indispensables au moins pour le positionnement du substrat dans le site actif.

Des acides aminés impliqués dans le mécanisme catalytique
- Utilisation d'un inhibiteur pour révéler un groupement fonctionnel indispensable à l'activité de l'enzyme
La plupart des travaux concernant l'activité de la saccharase ont été effectués avec l' isoenzyme externe de Saccharomyces cer. codée par le gène SUC2, appelée inv_sacc 2 ext. Il est donc intéressant d'établir par alignement des séquences la correspondance entre les ac.aminés de cette enzyme et ceux de son homologue, modélisé en 3D, et synthétisé par Thermotoga (voir alignement).
L'inv_sacc 2 est irréversiblement inactivée par le CBE (conduritol béta époxyde). Si l'enzyme est mise en présence de CBE marqué au tritium, la détermination de la quantité d'inhibiteur fixé par mole d'enzyme montre que l'inactivation ne porte que sur un seul ac. aminé, la digestion de l'invertase ayant permis d'identifier Asp23. C'est le carboxyl de la chaîne latérale de Asp23 (Asp17 dans inv. Thermotoga) qui réagit avec le CBE (voir schéma), ce groupement doit jouer un rôle fondamental dans la catalyse.
- La mutagenèse dirigée, autre méthode pour cibler les résidus ac.aminés indispensables à l'activité de l'enzyme
Le remplacement (méthode non décrite ici) de Asp23 par Asn23 dans l'inv_sacc2 conduit à l'inefficacité de l'enzyme, ce qui confirme l'importance de Asp23.
Le remplacement de Glu204 par Ala 204 diminue considérablement l'activité de l'enzyme sans affecter son affinité pour le substrat: Glu204 (Glu190 dans inv. Thermotoga) doit avoir un rôle déterminant dans le mécanisme qui permet l'hydrolyse rapide du saccharose.

Les carboxyles de la chaîne latérale des ac.aminés 23/17 et 204/190 se trouvent bien dans l'environnement proche du saccharose comme le montre le modèle du complexe enz-substrat.