Fermentation alcoolique

Suivi de la consommation de glucose
et de la production d'éthanol par la levure

TP TermS spé

Objectifs
-Compléter l'expérimentation assistée par ordinateur réalisée avec une suspension de Saccharomyces cerevisiae et qui permet de suivre l'évolution dans le milieu extracellulaire des concentrations de O2, C02, et éthanol avant et après l'ajout de glucose.
Voir résultats Exao.

-Etablir, par une méthode colorimétrique, une relation entre la consommation du glucose et la production d'éthanol par la cellule de Saccharomyces cerevisiae, l'expérimentation étant réalisée avec un faible volume de milieu et une petite quantité de levure (voir également culture en fermenteur) sur une durée d'environ 2,5 heures.

Principe
Suivre dans une culture de levure en conditions anaérobies d'une part la baisse de la concentration en glucose et d'autre part l'augmentation de celle de l'éthanol, les dosages étant réalisés par des méthodes enzymatiques.

Etapes du protocole
- Préculture: environ 1/2 heure avant la séance, placer 50ml de milieu Yeast Nitrogen base avec acides aminés (sans glucose) à 30°C. Ajouter 2 pointes de scalpel de levure ("poudre").
- Solution mère de glucose: 20 ml d'une solution de glucose à 20 g/l (à préparer au moment de l'emploi).
- Mise en route de la culture: dans un tube à essai, 9 ml de préculture + 1 ml de solution glucosée (concentration finale du glucose à t0 = 2g/l ). Recouvrir par une petite épaisseur d'huile de paraffine (anaérobiose). Boucher avec du coton cardé. Incuber à 30°C .
- Prélèvements: réalisés à la micopipette, à travers l'huile de paraffine, le premier après 45 min d'incubation.
- Dosages: un prélèvement de 10 µl de culture pour doser l'éthanol et un de 20 µl pour doser le glucose suffisent, les réactifs enzymatiques sont fournis ainsi qu'un étalon glucose (1g/l) et un étalon éthanol ( 0,8 g/l).

Quelques précisions concernant le protocole
- La culture n'est pas pure, l'ensemencement n'étant pas réalisé dans des conditions stériles mais le milieu utilisé (yeast nitrogen base), le pH bas, l'anaérobiose, vont grandement faire pencher la compétition en faveur des levures et on peut considérer que la contamination bactérienne ne peut être que très faible. Il est tout de même nécessaire de procéder à un contrôle microscopique en fin de manipulation.
- Les prélèvements n'influent pratiquement pas sur le volume total de la culture (10 et 20 µl à chaque mesure).
- Les dosages colorimétriques nécessitent l'emploi d'un spectrophotomètre. Pour chaque dosage, il est indispensable de se situer dans les limites de la linéarité, limites qui peuvent éventuellement être établies en construisant une courbe d'étalonnage pour le glucose et une autre pour l'éthanol.
Il faut vérifier que le faible volume (10 ou 20 µl) de milieu (avec les levures) ajouté aux réactifs n'influe pas sur la mesure de l'absorbance à la longueur d'onde choisie.C'est effectivement négligeable.
Les mesures réalisées avec les étalons doivent être conduites dans les mêmes conditions que celles faites avec le milieu.

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Auteur: Auclair Jean Jacques