Relation

information génétique-phénotype moléculaire

chez Escherichia coli

 

    Manipulation réalisée par des élèves de Terminale S (Atelier scientifique) au Centre de Biologie Moléculaire du CNRS à Orléans la Source sous la conduite de Monsieur Daniel Locker, professeur de génétique et de Madame Martine Decoville, maître de conférence, une partie étant reprise au lycée dans le cadre de la spécialité SVT.

                                                                                        Escherichia coli                                            

Objectif  
-Etablir par l'expérimentation une relation entre un changement de phénotype moléculaire chez E.coli et l'insertion d'un fragment d'ADN exogène dans un plasmide de la bactérie. Le caractère phénotypique étudié est l'aptitude à synthétiser la b galactosidase.
 -Faire évoluer les élèves dans un laboratoire de recherche pour leur donner l'occasion, de dialoguer avec les chercheurs, d'évoquer les sujets de recherche. Ainsi, ici, le gène inséré dans le plasmide est un gène de drosophile impliqué dans le développement qui a fait l'objet d'une publication.
Remarque: La manipulation réalisée permet également de comprendre comment on peut vérifier qu'un transgène est bien inséré dans un plasmide vecteur.

Expérimentation réalisée au CNRS

  1) Les deux souches d'Escherichia coli.

 Escherichia coli est cultivé sur un milieux nutritif gélosé adapté contenant:
 -X-gal, un substrat pour la b galactosidase
 -IPTG ,un inducteur de la transcription du gène qui code la b galactosidase 
 - un antibiotique, l'ampicilline. 
Toutes les bactéries qui se développent sont résistantes à l'ampicilline, elles ont intégré le plasmide pMAL-p2 qui possède le gène qui code la b lactamase, responsable de la résistance à l'antibiotique

  -Chaque colonie bleue est constituée par un clone de cellules qui synthétisent la b galactosidase. La b galactosidase catalyse l'hydrolyse du substrat X-gal, ce qui libère un produit bleuté. Les bactéries possèdent pMAL intact (en réalité, a complémentation), elles sont dites lac+.

 -Chaque colonie blanche est constituée par un clone de cellules qui ne synthétisent pas la b galactosidase fonctionnelle. Il ne peut y avoir  hydrolyse de X-gal, il n'y a donc pas de libération de produit bleuté, les bactéries sont dites lac-.Les bactéries sont issues par divisions cellulaires successives d'une bactérie initiale qui a reçu un plasmide p-MAL ayant intégré un ADN exogène (gène de drosophile). La présence de l'insert est responsable de l'absence d'expression du gène qui code la b galactosidase.

Pour mieux comprendre l'ensemble de la manipulation, les élèves peuvent obtenir des renseignements sur la structure du plasmide pMAL sur Internet ( site Biolabs).Une représentation simplifiée du plasmide intact et du plasmide recombiné est indispensable pour montrer où l'ADN de Drosophile a été inséré  après ouverture du plasmide par l'enzyme de restriction XmnI.

 2) Extraction - digestion des plasmides    
   - Le plasmide est extrait de chacune des souches  lac+ et  lac- puis traité par deux enzymes de restriction SacI et Hind III.

- Chaque étape du protocole doit être justifiée.La manipulation, non décrite ici, est entièrement réalisée par les élèves.
Avant d'opérer, Clémentine suit attentivement une démonstration réalisée par le professeur Daniel Locker.
  

 3) Séparation des produits de la digestion par électrophorèse
Les fragments de restriction obtenus sont séparés par electrophorèse en gel d'agarose 1%.

-Landry dépose dans un puits du gel le marqueur de taille (référence), d'autres élèves déposeront ensuite les produits de la digestion du plasmide extrait soit de la souche lac+ soit de la souche   lac-. Deux colorants (xylène cyanol et bleu de bromophénol) ont préalablement été ajoutés à l'ADN, ils permettront de suivre la progression de l'électrophorèse.

-Les dépôts sont terminés. La migration va commencer elle durera 1 heure sous une tension de 100v.

 Expérimentation réalisée au lycée
 -Les élèves qui ont réalisé l'expérimentation au CNRS fournissent à leurs camarades de la spécialité SVT les produits de la digestion des plasmides et les explications nécessaires pour réaliser la séparation des fragments de restriction  par électrophorèse. Le protocole suivi n'est qu'une adaptation de celui qui est présenté sur le site de l'Académie d'Orleans-Tours, il ne diffère de celui utilisé au CNRS que par le mode de révélation du gel (bleu de méthylène à la place du bromure d'éthidium).
-Une vérification du phénotype moléculaire de chaque souche d'E. coli est également proposée aux élèves. Il s'agit de tester la présence ou l'absence de b galactosidase par l'intermédiaire d'un substrat l'ONPG (incolore) dont l'hydrolyse, catalysée par l'enzyme,  libère l'orthonitrophénol jaune. Il suffit de prélever une colonie bleue et une colonie blanche, de mettre les bactéries de chaque colonie en suspension dans 4 ml d'eau distillée (agitation ),d'ajouter un disque d'ONPG,  de placer les tubes à 37°C . Après environ 20 min, le résultat du test peut être évalué.

Résultats: exploitation et commentaires

Electrophorégramme obtenu au CNRS par les élèves

     
Détails + Analyse 

Electrophorégramme obtenu au lycée

 
Détails + Analyse

Test à l'ONPG réalisé au lycée:
 Tube1:  la coloration jaune atteste que les bactéries de la colonie bleue, placées dans ce tube, synthétisent bien la b galactosidase.
 Tube2: les bactéries de la colonie blanche placées dans ce tube ne synthétisent pas la b galactosidase.

SYNTHESE attendue

Test X-gal
couleur des colonies

Test ONPG

Expression du gène LacZa

Phénotype moléculaire

Fragments de restriction
 Digestion du plasmide

 bleue

jaune +

 oui

b galactosidase

6320pb et 100pb

blanche

incolore -

non

pas de
b
galactosidase

6320pb et 1200pb (fragment avec un insert d'environ 1100pb)

 

La relation entre la présence de l'ADN exogène ( fragment d'environ 1100pb) et le phénotype moléculaire est vérifiée.

Travail réalisé par les élèves de TermS (Spécialité SVT et Atelier Scientifique) avec leur professeur
M. Auclair Jean Jacques. L'équipe remercie vivement Monsieur Daniel Locker et Madame Martine Decoville du CNRS pour leur très grande disponibilité.