L'électrophorèse des protéines
TPE TermS
Thème: espace et mouvement
SVT-Physique-Chimie
Protéines du blanc d'oeuf
Il
s'agit, ici, de restituer les étapes de la démarche suivie
par des
élèves de Term S pour répondre à la problématique
suivante:
Par quel mécanisme, l'électrophorèse sépare-t-elle les protéines d'un mélange?
Les élèves ont réalisé une électrophorèse de protéines en1èreS, ils connaissent l'importance de cette technique dans divers domaines de la biologie. Ils veulent comprendre ce qui détermine la migration différentielle des protéines au cours de l'éléctrophorèse.
-1ère étape: réalisation d'une électrophorèse de protéines (blanc d'oeuf suggéré par le professeur)
La manip permet de déterminer quel environnement physicochimique est nécessaire pour la mise en mouvement et la séparation des biomolécules. Quelques images illustrent le protocole.
L'électrophorégramme obtenu (voir photo) montre que le lysozyme a migré vers la cathode alors que les autres et notamment l'ovalbumine ont migré vers l'anode.Un calcul de la vitesse moyenne de migration pour chaque protéine a été fait.
Les facteurs qui jouent un rôle déterminant sont le courant électrique continu, la solution tampon qui maintient un pH = 8,6 dans le gel et la nature du support.
Les protéines se déplacent dans le support poreux sous l'effet d'un courant électrique, elles possèdent une charge globale. Elles n'ont pas toute la même charge, certaines sont chargées + (lysozyme), d'autres - (ovalbumine). Pour établir quels sont les groupements fonctionnels ionisables, responsables de l'existence de cette charge, il faut s'intéresser aux acides aminés, protides élémentaires constitutifs des molécules protéiques.
La découverte (avec l'aide du prof)) des propriétés acidobasiques des acides aminés permet aux élèves de comprendre le caractère amphotère de ces molécules. Les différents états d'ionisation que peuvent présenter les acides aminés en fonction des pKa des groupements -aNH3+, -aCOOH, et éventuellement du pKa d'un groupement de la chaîne latérale , en relation avec le pH sont établis ainsi que la notion de point isoélectrique.
Un dialogue avec l'enseignant conduit alors les élèves à envisager la réalisation d'une électrophorèse d'acides aminés pour matérialiser la réalité de leur ionisation. Le choix des aminoacides et du pH est fondamental. Un tableau avec les pKa et le pHi des différents acides aminés est indispensable.
L'électrophorégramme obtenu (voir image) montre un déplacement de Asp vers l'anode, de Arg vers la cathode, et une quasi-absence de migration pour Gly, à pH=6 (pHi de Gly). La relation entre l'état d'ionisation , la charge nette de l'acide aminé et le sens de sa migration est établie. Les molécules de Gly à charge nette nulle à pH = 6 ont tout de même un peu migré vers la cathode: le déplacement ne dépend pas que de la charge.
-4ème étape:
l'ionisation de certains ac.aminés responsable de la charge nette
de la protéine
Dans les protéines, les groupements -aNH2 et
-aCOOH des ac.aminés participent à la
formation des liaisons peptidiques, ils ne peuvent plus capter ou libérer
un proton. Le groupement -NH2 de la chaîne
latérale de Arg et Lys et le groupement -COOH de la chaîne latérale de
Asp et Glu peuvent, eux, présenter différents états d'ionisation en fonction
de leur pKa et du pH. Les résidus de ces ac. aminés jouent un rôle prépondérant
dans la détermination de la charge des protéines et de leur pHi.
La comparaison des structures primaires et celle des modèles 3D des 2 protéines avec Molusc permet d'établir le rapport Arg + Lys/Asp + Glu pour chacune des molécules (voir résultats).
La prise en compte de ces rapports, des pKa du groupement ionisable de la chaîne latérale de ces ac.aminés et du pH = 8,6 du tampon utilisé permet aux élèves de justifier la charge nette positive du lysozyme et celle, négative de l'ovalbumine.
Les élèves ont envisagé l'intervention d'autres paramètres en particulier la taille de la molécule, la nature du support et les intéractions possibles entre le support et la protéine mais cette partie, peu approfondie n'a pas eu de support expérimental. L'électroendosmose n'a pas été traitée.
L'étude, ainsi menée, a permis aux élèves de répondre à la problématique initiale.
