Evolution de la population des LT CD4+
évaluée en cytométrie en flux
et
progression de l'infection par le VIH
La numération absolue des LT4 peut éventuellement être remplacée par l'évaluation du rapport LT4/LT8.
Rq/ La charge virale est déterminée par RT-PCR.
Objectifs
Comprendre le principe de la cytométrie en flux. Evaluer par traitement informatique (logiciel WinMdi) de données cytométriques le rapport LT4/LT8 chez trois personnes différentes. Proposer pour chacune d'entre-elles, en relation avec les courbes de référence, l'état éventuel d'avancée de l'infection par le VIH.
Cette étude peut être intégrée assez tôt dans la progression concernant la partie "Immunologie" du programme. Elle sert alors d'introduction en permettant de formuler différentes problématiques qui seront examinées plus tard. Il me semble plus pertinent de la proposer alors que les élèves connaissent déjà les mécanismes de l'immunité, le rôle respectif et les caractéristiques des différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires, en particulier le rôle central des LT4.
Principe de la cytométrie en flux
C'est une technique qui permet la mesure de certaines caractéristiques optiques naturelles ou induites des cellules conduisant à les identifier individuellement et à les dénombrer. Elle est particulièrement bien adaptée pour l'exploration des cellules sanguines en particulier celle des sous-populations lymphocytaires.
Les cellules, préalablement préparées, éventuellement marquées par différents anticorps conjugués chacun à un fluorophore particulier, sont en suspension dans un liquide. Elles sont entraînées, en file indienne dans un mince filet liquide. La rencontre de chaque cellule avec un faisceau laser génère des signaux optiques caractéristiques qui sont canalisés, détectés séparément, convertis puis analysés par l'intermédiaire de l'informatique. Il s'agit de la lumière diffusée (sous différents angles) par la cellule et des différentes fluorescences émises par les fluorochromes associés aux anticorps spécifiques retenus par des marqueurs cellulaires membranaires.
Ainsi, chaque cellule se trouve caratérisée par différents paramètres optiques qui permettent son identification. Un cytomètre peut analyser ainsi au moins 1000 cellules par seconde.
Données concernant les fichiers utilisés et les limites de leur exploitation
Les fichiers disponibles (INRP) fournis par l'Institut Pasteur ont été obtenus après une préparation optimisée pour les lymphocytes. D'autre part, les granulocytes ne sont pas pris en compte correctement car ils dépassent l'échelle linéaire (granularité) avec laquelle les lymphocytes sont acquis. Ces fichiers ne sont pas adaptés pour une numération sanguine, car le nombre de granulocytes est grandement sous-estimé par rapport à celui des lymphocytes notamment.
Ils sont destinés à l'analyse des sous-populations de lymphocytes et permettent d'évaluer le rapport LT4/LT8. La cytométrie en flux ne donne pas ici directement le nombre absolu de cellules présentes initialement par mm3de sang car le volume de liquide entraîné n'est pas précisément mesurable.
Il est possible d'accéder à une numération absolue des LT4 (et éventuellement LT8) en nbre/mm3 de sang, paramètre plus significatif, à condition de disposer d'une numération formule sanguine (NFS) obtenue avec un hématimètre qui fournit le nombre absolu de lymphocytes présents dans le sang analysé (méthode à double plate-forme).
Rq/ On utilise maintenant des méthodes à plate-forme unique, le cytomètre calibré avec des billes fluorescentes (concentration connue) fournissant l'ensemble des données qui permettent d'obtenir la numération absolue des sous-populations lymphocytaires.
Travail à effectuer
- Cerner les différentes populations de leucocytes dans la fenêtre générée par WinMdi
Utiliser la représentation par points (un point = une cellule), choisir les paramètres FSC (taille) en X et SSC (granularité) en Y.
Identifier les populations de lymphocytes, monocytes, granulocytes en cohérence avec les observations cytologiques réalisées en parallèle sur un très bon frottis sanguin coloré par la méthode May-Grünwald Giemsa. Délimiter les populations. Enregistrer l'image.
Constater
que les granulocytes sont grandement sous-représentés dans la fenêtre WinMdi (par rapport au frottis).
Obtenir l' image numérisée d'un lymphocyte,d'un granulocyte, et d'un monocyte sélectionnés dans le frottis . Coller chaque image sur le document WinMdi en face de la population correspondante. Légender, imprimer.
Il s'agit de combiner les résultats d'une Numération Formule Sanguine et ceux de la cytométrie en flux pour accéder à une numération absolue des LT CD4+ ( et des LT CD8+) chez une personne témoin. La NFS est en général réalisée par un automate mais ici le comptage est pratiqué sur une cellule de Malassez (images fournies), hématimètre que les élèves connaissent bien. Une notice pour l'utilisation du logiciel WinMdi est fournie.
On considère que la NFS et l'analyse en cytométrie sont pratiquées sur des échantillons d'un même sang.
- Evaluer le nombre de Lymphocytes par mm3de sang à partir des images (fournies) d'une cellule de Malassez. Voir résultats.
- Mesurer par cytométrie en flux le nombre de LT CD4+ et de LT CD8+ présents dans l'échantillon de sang analysé. Enregistrer les images intéressantes.
- Déterminer le rapport LT CD4+ / LT CD8+à partir des données de la cytométrie
- Combiner les résultats de la NFS et ceux de la cytométrie pour obtenir la numération absolue (nbre/mm3 sang) des LT CD4+ (et des LT CD8+). Voir résultats.
- Comparer les résultats avec ceux qui apparaissent sur les courbes proposées ci-dessus.
Le rapport LT CD4+ / LT CD8+ = 2 et le taux de LT CD4+= 930 / mm3. Ces valeurs sont en accord avec celles du graphique fourni, elles correspondent bien à celles d'un sang témoin.
Traiter les fichiers fournis avec WinMdi. Enregistrer les images intéressantes.
L'un des fichiers correspond à un patient en phase asymptomatique, l'autre à un malade avec SIDA déclaré. Préciser si les résultats obtenus sont compatibles avec ceux que proposent les courbes de référence. Voir résultats.
