L'ARNm codant la globine b
présent dans les réticulocytes
Indications expérimentales
Il est possible d'extraire l'ARN total présent dans la fraction "réticulocytes" isolée à partir du sang, en présence d'une ADNase, pour limiter une éventuelle contamination par de l'ADN génomique fourni par des cellules nucléées (par ex. des globules blancs). Ensuite, pour caractériser un ARNm, par ex. celui de la chaîne b de Hb, plusieurs étapes sont nécessaires:
- Rétrotranscription des ARNm par action d'une ADN polymérase ARN dépendante, la réverse transcriptase : on obtient alors des molécules d'ADNc (c pour complémentaire) monocaténaires puis bicaténaires.
Parmi les molécules d'ADN bicaténaires obtenues par l'intermédiaire de la rétrotranscription, il peut y en avoir (une petite population) qui ont été synthétisées à partir d'une matrice correspondant à l'ARNm de la globine b, seulement si cet ARNm était présent dans l'extrait érythrocytaire. Dans ce cas, il est possible d'amplifier, par PCR, une séquence caractéristique (cible) de l'ADNc bicaténaire correspondant à cet ARNm, à condition de choisir correctement les amorces. Il y a parfois contamination par de l'ADN génomique provenant de globules blancs présents dans la fraction "réticulocytes" initiale.
Le principe de la PCR est décrit par ailleurs : voir TP PV92 .
Le couple d'amorces qui sera utilisé ici a été testé par E. Varlet-Marie pour caractériser, par PCR, l'ARNm de la globine b dans le cadre d'une recherche concernant l'action de l'EPO sur la synthèse d'Hb dans les réticulocytes.
Amorce gauche (forward) 5' GCAACCTCAAACAGACACCA 3'
Amorce droite (reverse) 5' AGCTCACTCAGTGTGGCAAA 3'
Il faut noter que la séquence des amorces est toujours donnée dans le sens 5' vers 3'comme d'ailleurs toutes les séquences nucléotidiques présentées dans les banques de données.
Travail à effectuer
1°/ Prévoir la taille du fragment cible d'ADNc (rétrotranscrit de l'ARNm de la globine b) qui sera éventuellement amplifié
- Entrer la séquence (fournie) de l'ADNc (correspond au brin non codant, sens 5' vers 3') dans la fenêtre du logiciel Primer3 puis proposer les deux amorces choisies. Le logiciel place les amorces et balise ainsi le fragment cible. Rapatrier l'image et déterminer la taille du fragment cible. Voir résultat.
2°/ Vérifier la correspondance entre séquence de l'ADNc utilisée et information contenue dans le gène HBB qui code la chaîne b de l'hémoglobine.
Pour cela, entrer la séquence ADNc dans la fenêtre du logiciel Blast, suivre les instructions (feuille TP) afin que le logiciel recherche dans le génome humain une séquence identique (ou très proche) de la séquence d'intérêt. Il localise la séquence sur le chromosome, dans une fenètre du NCBI Map Viewer. Ici, on doit retrouver la séquence de l'ADNc dans le gène HBB. Voir résultat.
3°/
Découvrir la structure du gène HBB avec exons et introns
Il apparaît que la séquence de l'ADNc se retrouve morcelée dans le gène. Cela signifie que certaines parties du gène (exons) qui se retrouveront transcrites dans l'ARNm sont séparées par des portions de séquences (introns) dont on ne retrouvera pas les transcits dans l'ARNm.
Lorsque le gène est exprimé, il est d'abord transcrit dans son ensemble (exons et introns) puis le transcrit primaire (pré-ARNm) obtenu subit une maturation (épissage) qui enlève les transcits d'introns et "colle bout à bout" les transcrits d'exons pour constituer l'ARNm mature qui sera traduit en séquence protéique.
Sur l'image extraite de la fenêtre du NCBI Map Viewer, faire apparaître les exons et les introns. Afficher le gène avec exons et introns, le pré-ARNm avec partie codante et non codante, la protéine (b globine), faire apparaître le codon initiateur et le codon stop. Voir résultat.
4°/ Confirmer la présence de l'ARN m de la globine b dans les réticulocytes.
Analyser un électrophorégramme obtenu avec les produits de PCR, d'origine érythrocytaire, amplifiés avec le couple d'amorces spécifiques de l'ADNc de la globine b. Conclure. Voir résultat.
Un des extraits réticulocytaires testé semble avoir été contaminé par de l'ADN génomique. Justifier cette observation en utilisant Primers3. Voir résultat
Rq/ La séquence de l'ADN génomique HBB est fournie.
