Séparation par électrophorèse


des produits de la digestion par HindIII, EcoRI et PstI

du plasmide pGLO

Détermination de la taille des fragments de restriction

La digestion séparée du plasmide par les enzymes HindIII, EcoRI et PstI achevée, il faut ajouter la solution de charge avec ses 2 indicateurs de migration le bleu de bromophénol qui migre comme un fragment d'ADN de 500 pb et le xylène cyanol qui se déplace comme un fragment de 5000 pb. Un échantillon avec le plasmide non digéré est également préparé ainsi qu'un marqueur de taille (ADN du phage l digéré par HindIII). Cinq dépôts sont effectués, chacun dans un puits du gel d'agarose puis l'électrophorèse est lancée. Après une migration de 40 min (100 v), le gel est révélé (bleu de méthylène).
Gel d'électrophorèse après révélation

Pour exploiter l'électrophorégramme, il ne faut pas perdre de vue que le plasmide pGLO est, à l'origine, une molécule d'ADN circulaire. Sa digestion par l'enzyme HindIII fournit 2 fragments (2 coupures), alors qu'en présence de l'enzyme EcoRI, on obtient 1 seul fragment (une coupure), le plasmide est linéarisé. En présence de l'enzyme PstI , les 2 fragments sont différents de ceux qui résultent de l'action de HindIII.
L'électrophorèse du plasmide non digéré sépare 2 formes, l'une (dominante) qui migre plus vite que la forme linéarisée et qui correspond à la configuration superenroulée et l'autre qui migre moins vite et qui correspond à la forme circulaire non superenroulée. Une première lecture du gel montre donc qu'en présence de chaque enzyme, l'ADN plasmidique est coupé différemment. Cela suggère que chaque enzyme reconnaît une séquence nucléotidique spécifique.

Estimation de la taille des fragments de restriction : exploitation quantitative de l'électrophorégramme

Principe
Le log décimal de la taille (en pb) d'un fragment linéaire peut être considéré comme inversement proportionnel à la distance (d) de migration. Il est donc possible de construire pour le marqueur de taille une courbe étalon log T = f (d), la taille de chaque fragment étant fournie (ou déterminée avec Anagène) et les distances mesurées sur le gel (ou mieux sur une image numérisée du gel). Pour estimer la taille des fragments obtenus avec le plasmide, il suffit de mesurer d et de déduire T en utilisant la courbe étalon.

Tableau de mesures


Le fragment de 125 pb du marqueur de taille n'est pas repérable sur le gel.
Détermination graphique de la taille des fragments de restriction
Tableau de résultats
Cette étude pratique permet une estimation de la taille des fragments d'ADN obtenus lorsque le plasmide pGLO est mis en présence de 3 enzymes de restriction différentes. Il est intéressant de confronter les résultats obtenus avec ceux que fournit une simulation par traitement de la séquence du plasmide, cette approche permettant en outre de mieux comprendre le mode d'action de ces enzymes.