Enzymes de restriction et plasmides

de précieux outils

pour la Biologie moléculaire

Enzymes de restriction et plasmides sont, à l'origine, des molécules bactériennes.
Un plasmide est un petit ADN circulaire comprenant un nombre restreint de gènes qui confèrent à la bactérie des propriétés particulières. Les enzymes de restriction protègent les bactéries contre les bactériophages puisque ces enzymes digèrent l'ADN introduit par ces virus dans la cellule bactérienne, bloquant ainsi leur réplication. L'ADN de la bactérie est protégé car les sites de restriction sont méthylés au niveau de certaines bases par des méthylases et donc non reconnus par les enzymes de restriction. EcoRI a été trouvée chez Escherichia coli, HindIII chez Haemophilus influenza et PstI chez Providencia stuarti.
Enzymes de restriction et plasmides au service de la biologie moléculaire.
L'étude proposée permet d'établir le mode d'action des enzymes de restriction, notion indispensable à la compréhension de leur utilisation dans l'établissement des diagnostics de maladies génétiques, les fragments de restriction étant alors utilisés pour caractériser les allèles des gènes (Southern blot , analyse des RFLP).
L'établissement de la carte du plasmide pGLO commencée au cours du TP "transformation bactérienne" avec le positionnement des gènes GFP, bla et araC peut être poursuivie ici (exploitation des résultats) avec la localisation des sites de restriction des enzymes EcoRI, HindIII et PstI .

Carte génétique du plasmide (voir TP" transformation")
ori : origine de réplication.
araC : gène codant la protéine araC, facteur de régulation, initialement de la transcription de l'opéron arabinose, et ici du gène GFP
PBAD : promoteur, initialement de l'opéron arabinose, et ici du gène GFP.
GFP : gène codant la Green Fluorescent Protein.
bla : gène codant l'enzyme b-lactamase responsable de la résistance à l'ampicilline.

Carte de restriction du plasmide pGLO établie à partir des résultats : sites reconnus par EcoRI, HindIII et PstI.

Il est alors facile d'amener les élèves à découvrir que le plasmide pGLO a été construit pour jouer le rôle de vecteur de transgenèse et permettre le transfert du gène GFP, son expression dans la cellule réceptrice, la réplication du plasmide et la sélection des bactéries transformées. Il faut attirer l'attention sur la position des sites de restriction (il y en a beaucoup d'autres), en particulier les trois qui sont situés en dehors des gènes d'intérêt, car ils ont été volontairement insérés dans cette position (ils font partie d'un polylinker). Ainsi l'action de EcoRI sur pGLO ( voir expérimentation) permet l'ouverture du plasmide tout en ménageant les gènes. Il est alors possible d'insérer un nouveau gène et d'obtenir un plasmide recombiné, la manipulation nécessitant un insert, lui-même, coupé par EcoRI à cause des bouts cohésifs. La fermeture du plasmide est assurée par une ADN ligase. On peut proposer au élèves d'envisager l'action de PstI sur pGLO (voir expérimentation) et les conséquences qu'aurait le transfert du plasmide ainsi recombiné et refermé sur le phénotype d'une bactérie réceptrice...... Les élèves ont un petit aperçu de l'intérêt que présente l'utilisation des enzymes de restriction dans le bricolage des vecteurs qui sont utilisés pour la transgenèse.