Bioinformatique

Activités motivées par l'expérimentation PCR

Pour que l'expérimentation apparaisse plus concrète et pour que les élèves puissent mieux la comprendre et l'interpréter, il faut qu'ils déterminent la localisation chromosomique du marqueur cible, qu'ils aient accès à la séquence des deux allèles rencontrés chez l'homme, qu'ils puissent simuler l'hybridation des amorces. Ils peuvent alors prévoir la taille des séquences amplifiées qui migreront dans le gel au cours de l'électrophorèse. Cette activité peut précéder la manipulation proprement dite, une partie peut être réalisée pendant la migration électrophorétique. La mise en oeuvre de cette activité nécessite l'utilisation du logiciel Anagène que les élèves connaissent et l'exploitation guidée de banques de données et du logiciel Primer3.
Les différentes versions du marqueur
Travail à effectuer (avec Anagène)
Les séquences d'ADN des deux allèles du marqeur existant chez l'homme sont proposées aux élèves (un seul brin dans le sens 5'-P vers 3'-OH) .
- comparer les séquences par alignement .
- repérer celle qui présente une insertion dite "séquence Alu", extraire cette séquence puis déterminer sa taille.
- comparer, par alignement, la séquence Alu extraite avec une séquence Alu humaine consensus*, repérer le site de restriction de l'enzyme Alu I, qui caractérise les éléments Alu présents dans le génome.
* Il y a dans le génome humain un peu plus de 106 éléments Alu qui présentent une homologie évidente, le séquençage de plusieurs dizaines d'entre-eux a permis d'établir une séquence Alu consensus et une structure type.

Résultats

Localisation du locus du marqueur
Pour établir la localisation chromosomique du marqueur biallélique cible, les élèves utilisent le programme Blast du National Center for Biotechnologie Information (NCBI). Pour initier la recherche, il faut entrer la séquence (fournie) de l'allèle sans insertion Alu, ensuite la progression est guidée.

Questions
- Déterminer sur quel chromosome et dans quel gène se situe la séquence.
- Indiquer quelle est la protéine codée par ce gène, et combien de résidus ac.aminés comporte sa structure primaire.
- Affiner la localisation de la séquence d'intérêt en précisant si elle se trouve dans un intron ou dans un exon
Saisir une image, imprimer, garder les documents qui permettent de visualiser la localisation du marqueur, sur le chromosome et dans le gène. Annoter.
Noter la taille en pb du gène, puis celle de l'ARNm produit. Constater une très grande différence entre les deux tailles . Si l'ensenble du gène est transcrit , l'ARN primaire obtenu (Pré-ARNm) subit une maturation complexe au cours de laquelle les transcrits de certaines séquences (introns) sont enlevés. Ainsi, il ne subsiste dans l'ARNm que les transcrits des séquences codantes (exons). Les élèves peuvent trouver surprenant que la taille de l'ARNm qui leur est proposée est encore nettement supérieure à celle qui est nécessaire pour coder la protéine Une repésentation graphique est accessible montrant à la fois la séquence du gène, les transcits d'exon et l'ARNm final qui est traduit. On peut alors repérer le codon initiateur qui code Met et le codon stop, signal de terminaison de la traduction.

Rq/ A la suite de la découverte de la possible présence d'une insertion Alu dans le marqueur étudié, son locus a été nommé PV92 (Predicted Variant). On a conservé cette désignation qui correspond pourtant à une nomenclature non actualisée des éléments Alu.


Résultats

Prévision de la taille des allèles du marqueur PV92 amplifiés par PCR
- Amorces utilisées
Ce sont les amorces choisies pour initier la phase d'élongation au cours de la PCR (voir principe) qui conditionnent la taille de la séquence amplifiée en balisant l'ADN cible par hybridation spécifique. Le fournisseur (BIO-RAD) ne communique pas la séquence de ses amorces. Celles qui sont proposées aux élèves ne correspondent pas exactement à celles qui sont utilisées mais elles donneraient des résultats très proches, les différences de taille des fragments amplifiés étant indiscernables sur le gel d'éléctrophorèse. Il faut préciser que les amorces "théoriques", si elles ne sont pas aussi bien optimisées que celles qui sont utilisées, se sont pas quelconques, elle ont été établies avec le logiciel spécialisé Primer3. Au niveau du lycée, on peut considérer que les amorces utilisées sont celles dont on fournit la séquence (toujours dans le sens 5' vers 3').
Amorce gauche (sens) : 5' AATCAGCCTCAGAAGCCAGA 3'
Amorce droite (antisens) : 5' TAAGTTCCCTGCCAACTGCT 3'
- Prévision de la taille des fragments amplifiés
Pour prévoir la taille des deux versions du marqueur cible qui seront amplifiées avec les amorces ci-dessus, on uitise le programme Primer3 .
- Synthèse
Faire apparaître, dans un tableau, la taille de la séquence qui sera amplifiée par PCR pour chacun des allèles du marqueur PV92.


Résultats