Principe de la Polymerase Chain Reaction

Mettre l'ADN génomique extrait en présence de la solution d'amplification (Taq polymérase + les 4 nucléotides + Mg2+) et des amorces puis soumettre l'ensemble à la succession des cycles thermiques (40) gérés par le thermocycleur programmé à cet effet. Chaque cycle comprend: - la dénaturation (94°C, 1 min) - l'hybridation ou amorçage (60°C, 1 min) : l'une des amorces s'hybride avec une courte séquence du côté 3' de la cible, l'autre avec une courte séquence du côté 3' du brin complémentaire de la cible. L'excès d'amorces par rapport aux brins d'ADN génomique est en faveur de l'hybridation des amorces aux dépends de la formation de duplex d'ADN génomique. - l'élongation (72°C, 2 min) : synthèse des nouveaux brins complémentaires de l'ADN matrice, à partir des amorces, dans le sens 5' vers 3', catalysée par une ADN polymérase thermostable (Taq polymérase à l'origine produite par une bactérie Thermus aquaticus) qui utilise les 4 DNTs (A,T,G,C) pour la synthèse de la chaîne polynucléotidique et Mg2+ comme cofacteur. Voir modèle moléculaire de la Taq DNA polymerase en action.

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L'animation présente les 3 premiers cycles d'une amplification par PCR. Seuls les brins d'ADN conduisant le plus rapidement à l'obtention des fragments cibles sont conservés sur la scène de l'animation. A la fin du troisième cycle, apparaissent les 2 premiers fragments courts limités par les amorces et contenant la séquence cible. Les cycles suivants conduisent à l'amplification exponentielle de l'ADN cible, les brins plus longs conduisant également à la synthèse de fragments courts. Après 30 cycles, il y a théoriquement 1 milliard de copies de l'ADN cible.