Séparation par électrophorèse

des protéines extraites de muscles squelettiques
L'électrophorèse des protéines est en général réalisée en gel de polyacrylamide car ce support a un pouvoir de résolution nettement supérieur à celui de l'agarose dont les gels sont cependant utilisés pour séparer en routine les grosses protéines sériques. L'électrophorèse proposée ici devrait donc idéalement être réalisée avec un gel de polyacrylamide mais le principe de précaution recommande de ne pas proposer la manipulation de ce support (supposé cancérogène) à des élèves de lycée. Le gel est donc préparé à partir de PCR low-melt agarose et toute l'expérimentation peut être réalisée avec le matériel habituellement utilisé pour l'électrophorèse d'ADN (moule, peigne, cuve horizontale, générateur...)

Extraction
 Un petit fragment de muscle squelettique est placé dans le tampon d'extraction (tris, SDS, bleu de bromophénol, glycérol). Ce tampon permet de solubiliser les protéines. En effet, le Sodium Dodécyl Sulfate, détergent anionique, désorganise les membranes en déplaçant et solubilisant les lipides. Il se lie aux protéines par des interactions hydrophobes à l'origine de leur dénaturation partielle. Les complexes protéines-SDS passent en solution. Il suffit alors de prélever quelques dizaines de µl de solution pour disposer d'un échantillon de protéines musculaires.
Dénaturation complète
Un passage (5 min) à 95-100°C est nécessaire pour compléter l'action dénaturante du SDS. A l'issue de ce traitement, les structures secondaire, tertiaire et quaternaire des protéines sont détruites. Ainsi, les sous-unités qui appartenaient à la même molécule sont séparées et chaque chaîne linéaire est "recouverte" de molécules de SDS, ce qui lui confère une charge négative globale qui gomme celle de la protéine native. Chaque molécule de myosine libère 2 chaînes lourdes semblables et 4 chaînes légères identiques deux à deux.
Préparation du gel d'agarose
Le gel est préparé avec de l'agarose ( normalement pour ADN de petite taille) à 4% dans le tampon TGS (tris-glycine-SDS). Il ne faut pas, à cause de la présence du SDS, faire fondre la gélose au four à micro-ondes.
Mise en place du gel
Une fois préparé, le gel est placé dans la cuve, puits du coté cathode. La cuve est remplie avec le tampon TGS de façon à recouvrir le gel avec une faible épaisseur de liquide.

Echantillons à déposer
- Extraits qui contiennent, en solution, les protéines musculaires dénaturées (linéaires) recouvertes de SDS donc chargées négativement, du bleu de bromophénol qui permettra de suivre l'avancée de la migration et du glycérol, densifiant indispensable pour éviter la diffusion de l'échantillon dans le tampon au moment du dépôt.
- Protéines musculaires de référence, fournies lyophilisées et traitées (dénaturées) comme les protéines extraites. Elles ont été isolées à partir de myofibrilles de muscle squelettique de lapin.
- Marqueur standard qui contient 10 protéines de masse moléculaire connue.
Dépôts
20 µl de chaque échantillon sont déposés dans chacun des puits.

Les dépôts viennent d'être réalisés.
La flèche permet de repérer celui qui correspond au marqueur de masse moléculaire (précoloration).
Migration
La tension appliquée est de 100 volts. L'électrophorèse a lieu dans des conditions dénaturantes, les édifices moléculaires chargés négativement se déplacent vers l'anode avec une vitesse qui dépend essentiellement de leur masse moléculaire. La position du bleu de bromophénol nous donne une indication sur l'emplacement des molécules protéiques. La durée de la migration est de 45 min.
Début de la migration.
Fixation
La migration terminée, il faut fixer les protéines dans l'agarose car elles ont tendance à diffuser. Le gel est placé dans un fixateur (ac.éthanoïque + éthanol) qui précipite sur place les protéines.
Gel sorti de la cuve et placé dans le fixateur.
Le bleu de bromophénol est bien visible. La piste marquée M correspond au marqueur de masse moléculaire.
Coloration puis décoloration
La fixation des protéines terminée, le gel est placé dans le colorant de Coomassie (BIO-RAD). Les bandes de protéines se colorent en bleu. Ensuite, le gel est décoloré avec de l'eau , les bandes sont de plus en plus nettes.