Analyse de la séquence du plasmide pGLO

Repérage des gènes GFP et bla

Le traitement de la séquence du plasmide pGLO par le logiciel Anagène permet de déterminer sa taille précise (5371pb) et de retrouver les séquences correspondant respectivement aux gènes GFP et bla qui nous intéressent plus particulièrement dans cette étude. Pour cela, il faut utiliser le module qui affiche les séquences dites ouvertes par identification des codons d'initiation (ATG) et de terminaison (stop). Trois cadres de lecture (C1, C2,C3) doivent être envisagés suivant que l'on commence par le premier, le deuxième ou le troisième nucléotide.On peut demander la traduction des séquences ouvertes et même les extraire. Parmi elles on reconnaît facilement celle qui code la GFP et celle qui code la b-lactamase (nombre d'ac.aminés, comparaison avec la séquence de la protéine founie par le logiciel de manipulation des modèles moléculaires).
Repérage du gène qui code la GFP
Le début et la fin de la séquence (brin non transcrit) d'ADN qui code la GFP ainsi que le début (extrémité N terminal, y compris MET) et la fin (extrémité C terminal) de la protéine apparaissent dans les 2 fenêtres ci-dessous. La séquence codante commence avec le nucléotide 1342 et se termine avec le nucléotide 2062 (en incluant le codon stop).
Repérage du gène bla qui code la b-lactamase
Le début et la fin de la séquence (brin non transcrit) d'ADN qui code la b-lactamase ainsi que le début (extrémité N terminal, y compris MET) et la fin (extrémité C terminal) de la protéine apparaissent dans les 2 fenêtres ci-dessous. La séquence codante commence avec le nucléotide 2636 et se termine avec le nucléotide 3497 (en incluant le codon stop).

Extraction des séquences ADN codant pour la GFP et pour la b-lactamase et des séquences protéiques correspondantes.
Le logiciel Anagène permet d'éditer les séquences sélectionnées. L'image ci-dessous en montre le début. On peut ensuite vérifier que la sructure primaire de chaque protéine correspond bien à celle des modèles moléculaires de la GFP (1gfl.pdb) et de la b-lactamase (1jvj.pdb) étudiés avec Chime ou Rastop. En réalité il y a de minimes différences ( résultats de mutations ou absence de quelque Ac. aminés en début ou fin de chaîne).

On retrouve bien les résidus Ser 66, Tyr 67,Gly 68 responsables de la fluorescence de la GFP repérés dans le modèle moléculaire en positions 65, 66, 67 (absence de Met1).