Les objectifs
- Comprendre, à travers la pratique comment l'utilisation des enzymes de restriction permet d'établir des cartes de restriction qui peuvent conduire à repérer une anomalie génique (ici une délétion).
-Etablir (simulation) un diagnostic prénatal de pathologie génétique à partir des profils de restriction obtenus.
Les acquis
Mode d'action des enzymes de restriction, pratique d'une électrophorèse de fragments de restriction, compétences acquises à l'issue de la séance de TP précédente au cours de laquelle l'électrophorèse des fragments de restriction de l'ADN du phage l digéré par EcoRI et par HindIII a été réalisée et exploitée.
Les échantillons d'ADN
On peut présenter le fragment d'ADN (cloné) analysé ici (produit Jeulin) comme faisant partie du très grand gène DMD qui code la dystrophine (locus sur partie différentielle de X). On considère qu'il comprend plusieurs exons et introns et qu'il correspond à une " zone chaude" de délétions. En réalité, il s'agit d'un ADN qui a une toute autre origine et la méthode normalement utilisée pour révéler les éventuelles délétions dans le gène DMD (amplification par PCR de plusieurs zones, beaucoup plus courtes) est assez éloignée de celle qui est proposée ici.
On dispose de 3 échantillons d'ADN (cloné), l'un fourni par un garçon atteint de myopathie de Duchenne, l'autre par un garçon de la même famille, non atteint, le 3^ème appartenant à un foetus de la même famille et de sexe masculin (voir arbre généalogique).
Le protocole et le matériel
Digestion de l'ADN par Xho1 d'une part et par Bam H1 d'autre part : durée 1h, protocole proposé par le fournisseur. Le marqueur de taille est prêt.
Electrophorèse des fragments de restriction obtenus, en gel d'agarose, révélation par le bleu de méthylène, protocole proposé par le fournisseur.
Les étapes de l'étude
-Construction de la carte de restriction du fragment d'ADN "normal" à l'aide d'Anagène (la séquence entrée dans le logiciel n'est pas celle de l'ADN étudié mais elle a exactement la même taille et présente les mêmes sites de restriction). Ce travail permet de déterminer avec précision la taille des fragments de restriction qui seront séparés par électrophorèse, taille par ailleurs mesurable sur l'électrophorégramme mais avec moins de précision.
-Construction de la carte de restriction du fragment d'ADN founi par le garçon malade à partir de l'électrophorégramme, comparaison avec l'ADN de référence et mise en évidence d'une délétion.
-Etablissement du diagnostic prénatal (simulation) à partir du profil de restriction du foetus déterminé par lecture du gel.
Les résultats

Carte de restriction ADN "normal" (Anagène).
Electrophorégramme obtenu en Tp: repérage de la délétion, marqueur de la pathologie.
Electrophorégramme obtenu en Tp: diagnostic prénatal.