Amplification des marqueurs par PCR

Principe: mettre l'ADN extrait en présence de la solution d'amplification (Taq polymérase + les 4 nucléotides + Mg2+) et des amorces puis soumettre l'ensemble à la succession des cycles thermiques imposés par le thermocycleur, chaque cycle comprenant la dénaturation (94°C, 1 min), l'hybridation ou amorçage (59°C, 1 min) et l'élongation (72°C, 2 min). Voir animation flash.
Voir modèle moléculaire de la Taq polymérase en action
Préparation des tubes de PCR
L'échantillon d'ADN doit être pipeté dans l'extrait alimentaire avec précaution car il ne faut pas entraîner de billes de matrice fixatrice de cations. Ici, les amorces OGM colorent le contenu du petit tube de PCR en rouge alors que les amorces PS II colorent ce contenu en vert .
Les 6 tubes présents sur l'image sont prêts pour la PCR. On repère facilement ceux qui contiennent les 2 couples d'amorces OGM et ceux qui contiennent le couple amorces PSII.
Le contenu de chaque tube apparaît dans le tableau ci-dessous.

Lancement de la PCR
Chaque groupe a donc préparé 6 tubes qui sont placés dans le thermocycleur programmé pour 40 cycles. Cette longue étape du protocole peut être lancée au début d'un cours (entre les 2 séances de TP), l'amplification étant entièrement gérée par l'appareil.

Taille des cibles à amplifier
Les fragments d'ADN qui doivent théoriquement être amplifiés sont d'une part le marqueur du gène du PSII de 455 pb et d'autre part ceux du transgène, l'un spécifique du promoteur, de taille 203 pb, l'autre spécifique du terminateur, de taille 225 pb.