Séparation des produits de PCR

par

électrophorèse

Après amplification, les produits issus de la PCR sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Cette étape du test, la dernière, peut être le support d'une 2ème séance de TP.

Préparation du gel
Gélose à 3% dans le tampon TAE ( concentration élevée pour permettre la séparation de fragments d'ADN de quelques centaines de nucléotides), solubilisation au micro-ondes, puis coulage (voir image) dans un moule. Après solidification, le peigne est retiré, le gel est prêt.

Préparation des produits issus de la PCR
Chaque tube passé dans le thermocycleur reçoit le tampon de charge Orange G.
Un tube avec marqueur de taille est également préparé.

Charge du gel
Le gel est chargé alors qu'il est déjà dans la cuve, recouvert par une faible épaisseur de tampon TAE. Chaque puits reçoit 20 µl, le marqueur de taille est déposé en position 7.

Migration et séparation des fragments d'ADN
Le gel immergé dans le tampon TAE est soumis
à une tension de 100V. La migration des fragments d'ADN est indirectement suivie par la progression de l'orange G (migre plus vite qu'un fragment de 50 pb), la position des colorants des amorces est également repérable. La migration dure 30 min.

Révélation du gel
Le gel est passé dans le colorant de l'ADN "Blast Fast" puis rapidement décoloré, il est interprétable une dizaine de minutes après la fin de la migration. Voir résultat.