Hétérotrophie pour le carbone

Culture de la levure Saccharomyces cerevisiae

Objectifs
Comparer la croissance de populations de Saccharomyces cerevisiae cultivées en milieu liquide soit minéral soit organique, à la lumière ou à l'obscurité. Etablir la notion d'hétérotrophie.
Souche et milieux
-Des pré-cultures sont proposées par les fournisseurs en milieu liquide ou sur gélose. On peut également utiliser de la poudre (Sigma) ou de la levure de boulanger mais il faut, alors, obtenir une culture pure par repiquages sur gélose pour prélever quelques colonies afin de préparer la suspension mère (dans l'eau stérile) au début de la séance de TP.
- Le milieu "yeast nitrogen base sans ac.aminés" est intéressant car il est minéral (aux vitamines près) et on peut lui ajouter une source de carbone organique non azotée (glucose, saccharose, lactose...). Voir image à droite.
Pour affiner l'étude des besoins nutritifs de la levure, il est possible d'utiliser également le milieu "yeast nitrogen base avec acides aminés" . Voir composition des milieux

Protocole
Chaque groupe prépare 4 tubes de culture en minimisant au maximum les contaminations possibles (eau , tubes, pipettes et environnement stériles), la poudre de milieu et le glucose n'étant pas stérilisés. Il faut préciser que le milieu final est optimal pour l'étude des besoins nutritifs de Saccharomyces et que son pH bas est défavorable au développement des bactéries. Après une semaine de culture, les contaminations sont peu fréquentes.
-tube 1: 0,06g de milieu " nitrogen base W/O amino acids" dans 10 ml d'eau distillée, milieu minéral inoculé avec 0,5 ml de suspension de levure.Obscurité.
-tube 2: idem tube1. Milieu minéral. Lumière.
-tube 3: 0,06g de milieu minéral + 0,4 g de glucose dans 10 ml d'eau, milieu organique inoculé avec 0,5 ml de suspension de levure.Obscurité.
-tube 4: idem tube 3. Milieu organique. Lumière.
A t0, l'absorbance A600 (l = 600 nm) ne doit pas dépasser 0,1.
Quelques remarques pour alimenter une discussion critique du protocole : le milieu de culture n'est pas stérile; le milieu "nitrogen base" contient des vitamines, il n'est donc pas strictement minéral; dans les tubes 3 et 4 la concentration initiale des composés minéraux est la même que dans les tubes 3 et 4 mais la pression osmotique diffère à cause de la présence de glucose.

Résultats

Conditions de culture
20°C
Tubes
Absorbance
(l = 600 nm )
Nombre de cellules
en millions/ml
to
t7j
to
t7j
Milieu minéral.Obscurité
1
0,09
0,12
1,9
2,1*
Milieu minéral. Lumière
2
0,09
0,1
1,9
1,7
Mileu organique. Obscurité
3
0,1
0,82
1,9
14*
Milieu organique. Lumière
4
0,1
0,80
1,9
13,1
Cuves correspondant aux 4 tubes (plus blanc) préparées pour la mesure de l'absorbance A600 (l = 600 nm). t7j

Résultats d'un groupe, considérés comme représentatifs de ceux de la classe.
Pour le nombre de cellules à t0, mesure réalisée pour 1 des tubes et étendue aux 3 autres. Pour les résultats marqués*: images disponibles

Test glucose
tubes 3 et 4

Commentaires
Les résultats quantitatifs obtenus par les élèves d'une classe ne sont, en général, pas parfaitement homogènes (en particulier les comptages) mais si on les considère dans leur ensemble, ils montrent bien que la croissance d'une population de cellules de levure n'a pas lieu en milieu minéral mais qu'il suffit d'ajouter du glucose à ce milieu pour qu'il y ait multiplication des cellules (x7 en une semaine par ex : voir tableau) par bourgeonnement.
La lumière n'influe pas sur la croissance. Le test glucose montre que les molécules de ce glucide, présentes à t0 dans le milieu ont disparu à t7j.
La cellule non chlorophyllienne de Saccharomyces ne peut produire de la matière (synthèses) et survivre que si elle prélève, en plus d'ions minéraux, des molécules organiques préexistantes, comme le glucose, dans le milieu extracellulaire. Elle est hétérotrophe pour le carbone.
Le glucose est une molécule organique non azotée, la cellule de levure utilise ici comme seule source d'azote les ions minéraux NH4+ présents dans la solution nutritive, elle est donc autotrophe pour l'azote.

Compléments
- Croissance en fermenteur de Saccharomyces avec suivi spectrophotocolorimétrique de la consommation du glucose. Voir autre TP.
- Suivi (spectro) de la consommation du glucose par Saccharomyces (culture en tube). Voir autre TP.

Auteur, professeur SVT: Auclair Jean Jacques
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