Aptitude de Saccharomyces cerevisiae à utiliser différents glucides

comme métabolites respiratoires (EXAO)

L'étude de la croissance de populations de Saccharomyces en milieu YNB complémenté par différents glucides a montré d'une part l'aptitude de la levure à produire de la biomasse et à se diviser alors que la seule source de carbone disponible est soit le glucose, soit le maltose, soit le saccharose et d'autre part son incapacité à croître en milieu lactosé. La levure utilise le glucose comme métabolite respiratoire (voir avant) , les nutriments maltose et saccharose doivent pouvoir alimenter en métabolites les voies cataboliques de la respiration cellulaire.

Objectifs
- Tester en EXAO, en suivant la consommation d'O2, l'aptitude de Saccharomyces cerevisiae à oxyder par la respiration les disaccharides maltose, saccharose et lactose ainsi que le glucose (référence).
- Etablir une relation entre aptitude à utiliser les disaccharides commme nutriments respiratoires, protéines, gènes, expression des gènes : exploiter les résultats expérimentaux et questionner la banque de données Yeastgenome (en anglais).

Protocole
- Suspension de levure 20g/l dans l'eau, préalablement aérée pendant plusieurs heures.
- Solutions 1M de glucose, maltose, saccharose, lactose.
- Dispositif EXAO avec sonde oxymétrique.
Placer 12 ml de suspension de levure dans le bioréacteur, lancer l'agitation, attendre la stabilisation, puis commencer l'enregistrement. Après un court délai, ajouter 0,1ml de nutriment à tester.
La concentration finale du glucose doit être peu élevée pour éviter l'effet Crabtree.

Résultat

- Avant l'ajout du glucide : consommation faible d'O2 , à vitesse constante, à peu près identique pour les 4 essais. L'IR des cellules est basse, elles oxydent des métabolites résiduels.
- Après l'ajout du glucide : consommation d'O2 à vitesse beaucoup plus élevée en présence de glucose et de saccharose mais sans changement en présence de maltose et de lactose.
L'expérimentation confirme l'utilisation, par la cellule de Saccharomyces cerevisiae, du glucose comme substrat respiratoire. Elle montre, comme prévu, que pour cette cellule, le saccharose est bien "un nutriment respiratoire", alors que le lactose n'est pas exploité (voir avant, absence de lactase et de lactose perméase). Le maltose, pourtant capable d'assurer en tant que seule source de carbone, la croissance d'une population de levure en milieu YNB, n'est pas utilisé ici comme nutriment respiratoire ce qui semble contradictoire.
Comment expliquer la discrimination opérée par la cellule de levure vis à vis des "nutriments respiratoires" potentiels?

Relation entre gènes, protéines et aptitude de la cellule de levure à utiliser les disaccharides
- Des protéines qui conditionnent l'utilisation des nutriments
Pour qu'un disaccharide puisse être métabolisé il faut qu'il puisse entrer dans la cellule en étant pris en charge par un transporteur ( protéine intégrée à la membrane plasmique) spécifique, il sera ensuite hydrolysé dans le cytosol par une enzyme. Le disaccharide peut également être hydrolysé dans le milieu extracellulaire par l'intervention d'une hydrolase sécrétée. Ce sont ensuite les produits d'hydrolyse qui sont pris en charge par des perméases spécifiques.
- Les gènes qui codent les protéines déterminantes
Pour chacun des disaccharides testés, il est possible de savoir si Saccharomyces cerevisiae posséde un (ou plusieurs) gène codant pour une hydrolase sécrétée ou non, une perméase. Pour cela il suffit d'interroger le site Saccharomyces Genome Database .

  • Cas du lactose : le génome ne contient pas de gènes pouvant coder une lactase ou une lactose perméase
  • Cas du saccharose : le génome peut contenir jusquà 6 gènes codant une invertase mais la souche de référence ne présente que SUC2, dont le locus est sur le chromosome IX. Ce gène peut coder 2 isoformes de la saccharase, l'une sécrétée, glycosylée, soumise à la répression par le glucose, l'autre intracellulaire, non glycosylée et non soumise à la répression ( peu produite, rôle inconnu).
    Le génome ne présente pas de gène connu, pouvant coder un transporteur (transporter en anglais) ou perméase pour le saccharose (sucrose).
    Rq/ La transcription de SUC2 est réprimée en présence d'une concentration en glucose extracellulaire importante mais si elle passe sous un certain seuil, il y a alors induction.
  • Cas du maltose : le génome contient plusieurs complexes multigéniques avec un gène codant une maltase intracellulaire et un gène codant une maltase perméase. L'image ci-dessous rassemble quelques informations tirées du site SGD concernant un des complexes appelé MAL1 à localisation subtélomérique VII. A proximité des gènes MAL11 et MAL12 se trouve le gène MAL13 qui code un activateur transcriptionnel des 2 autres gènes, l'expression des gènes qui codent la maltase et le transporteur, étant à l'origine, induite par le maltose extracellulaire.

Ainsi, en culture, dans un milieu YNB avec maltose comme seule source de carbone, l'induction de l'expression des gènes qui codent la maltose perméase et la maltase a lieu et le maltose peut entrer dans la cellule où il est rapidement hydrolysé, les molécules de glucose obtenues sont ensuite métabolisées. Dans l'expérimentation ci-dessus, les levures sont préalablement placées dans de l'eau pendant plusieurs heures puis mises en présence de maltose pendant la durée de l'enregistrement (4 min). Le délai est bien trop court pour que l'induction par le maltose s'installe, il ne peut être utilisé alors que ce disaccharide repésente pour la levure un "nutriment" respiratoire potentiel qu'elle pourra oxyder à partir du moment où elle sera adaptée au maltose.

Schémas synthétiques: cas du saccharose et du maltose

Pour visualiser l'autre schéma, survolez l'image avec la souris.
Rq: la saccharase sécrétée par Saccharomyces cerevisiae est très facile à obtenir et à tester : voir TP invertase, voir TP réacteur à invertase immobilisée.
Auteur, professeur SVT: Auclair Jean Jacques
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