Extraction puis séparation par électrophorèse

des isoenzymes de la LDH

L'extraction et la séparation des isoenzymes correspondent aux étapes vraiment expérimentales de l'étude. L'électrophorèse permet un réinvestissement des acquis de 1èreS dans sa réalisation et dans son interprétation ( réaction enzymatique, propriétes des protéines).

• Objectifs
  Il s'agit d'une part de séparer les isoenzymes de la LDH extraites d'organes divers (coeur, muscle, foie, rein...) d'un organisme et d'autre part de comparer les résultats obtenus à partir d'organes appartenant à des animaux choisis dans les différentes classes deVertébrés et éventuellement parmi les Iinvertébrés. L'analyse des électrophorégrammes doit conduire les èlèves à poser diverses questions qui vont motiver la partie suivante de l'étude.
• Les étapes du protocole
  -Extraction: quelques grammes de matériel frais (acheté en boucherie ,en poissonnerie) sont mis en présence d'un tampon phosphate puis broyés. Il faut ensuite filtrer puis centrifuger à froid le filtrat pour récupérer le surnageant qui contient la fraction LDH.
  -Electrophorèse en gel d'agarose: dépôts de 3µl chacun, migration sous une tension de 100V pendant 20 minutes.
  -Révélation du gel: elle met en jeu la réaction enzymatique catalysée par la LDH. Le gel est recouvert d'un réactif qui contient du lactate (substrat) du NAD+ (coenzyme) et un chromogène. La réaction ne se déroule dans le gel qu'en présence des molécules de LDH, le chromogène se colore et précipite: des bandes colorées révèlent alors la présence des isoenzymes.

• Organisation de la séance de TP
  Les fragments d'organes de Vertébrés ,coeur, muscle, foie, rein de lapin, de porc, de poulet ou de boeuf , muscle de poisson ...sont répartis entre les groupes d'élèves. Un invertébré (moule , crabe ou autre) peut également être fourni (ainsi qu'un végétal). Après extraction chaque groupe réalise deux dépôts puis l'électrophorèse se déroule suivie de la révélation du gel. Il faut environ 40 minutes pour extraire, séparer et révéler. Le gel doit ensuite être séché pendant environ 30 minutes . Il peut être manipulé et scanné avant la fin de la séance de TP.
  L'électrophorèse des chaînes protéiques séparées (traitement à l'urée) peut également être proposée.

Pour plus de détails sur le protocole, contactez Jean Jacques Auclair , professeur de SVT