- Vérifier que les cellules du myocarde d'un mammifère, synthétisent bien, après la naissance, plusieurs isoenzymes de la LDH, en particulier la LDH1 (H4) et la LDH2 (H3M1) comme l'indiquent les résultats de la recherche qui a motivé cette étude.
- Montrer que la LDH cardiaque peut catalyser soit la réduction du pyruvate en lactate (fermentation lactique) soit la réaction inverse, oxydation du lactate en pyruvate (qui sert alors de métabolite respiratoire). Il s'agit ici de réinvestir les connaissances pratiques et théoriques acquises en enzymologie.
Les isoenzymes la LDH cardiaque séparées par électrophorèse
- Protocole
Matériel biologique: 2g de coeur de porc
Extraction dans tampon pH = 7,4 puis centrifugation
Electrophorèse en gel, à pH = 8,2
Révélation spécifique à l'aide d'un réactif qui contient du lactate, NAD+, un chromogène. La réaction d'oxydation du lactate en présence de LDH produit NADH qui est repris par une deuxième réaction conduisant à un produit coloré.
- Résultats
Les 5 isozymes sont capables de catalyser l'oxydation du lactate.
La LDH catalyse la réduction du pyruvate en lactate
La réaction de réduction du pyruvate peut être suivie par l'enregistrement de l'absorbance A340 en fonction du temps qui traduit l'oxydation du NADH en NAD+, la forme red du coenzyme absorbant bien à l=340 nm alors que la forme ox n'absorbe pas. L'absorbance va donc diminuer.
- Protocole
Matériel biologique: 2g de coeur de veau
Extraction dans tampon pH = 7,4 puis centrifugation
Pyruvate 21 mmoles/l , NADH 2,5 mmoles/l
La cuve (2,5 ml tampon pH = 7,4 + 0,1 ml pyr. + 0,1 ml NADH + 0,1ml d'extrait enzymatique) est placée dans un spectro (l=340 nm ) intégré à une chaîne exao.
- Résultats
La LDH catalyse l'oxydation du lactate en pyruvate
La réaction peut théoriquement être suivie par l'enregistrement de l'absorbance A340 en fonction du temps. L'absorbance devrait augmenter car il y a réduction du NAD+ en NADH. Plusieurs essais, infructueux, ont été tentés avec l'extrait enzymatique obtenu dans le tampon à pH = 7,4 mis simplement en présence de lactate et de NAD+. Il semble que le pH du milieu réactionnel était trop éloigné du pH optimal qui, pour cette réaction (in vitro) est donné proche de 10 (donc très différent de celui de la réaction inverse). Un autre protocole a alors été proposé avec utilisation du réactif qui permet de révéler les isoenzymes de la LDH sur le gel d'éléctrophorèse.
- Protocole retenu
Dans la cuve: 2,5 ml de tampon
pH = 7,4 + quelques gouttes de réactif avec lactate, NAD+, chromogène ox + 0,1ml d'extrait enzymatique. On suit indirectement la formation de NADH par la réaction colorée qui réduit le chromogène donnant un composé avec un maximum d'absorption pour l= 595 nm.
-Résultats
Bilan de l'étude expérimentale
- Le myocarde des mammifères produit bien après la naissance 5 isoenzymes de la LDH avec prédominance des formes LDH1 (H4) et LDH2 (H3M1).C'est donc la chaîne H qui est la plus abondante.
- Ces isoenzymes sont capables de catalyser l'interconversion pyruvate / lactate cependant les cinétiques enregistrées ici ne permettent pas de déterminer si la LDH cardiaque est plus efficace pour catalyser la réaction dans l'un ou l'autre sens car elles ont été réalisées dans des conditions très différentes ( et non optimales).
