La LDH catalyse la réaction d'oxydation du lactate en pyruvate. Elle fixe le coenzyme d'oxydo-réduction NAD⁺ (forme ox ) qui participe directement à la réaction et qui devient NADH (forme red) alors que le substrat lactate est oxydé en produit pyruvate. Le modèle moléculaire ci-dessus montre une chaîne H de LDH de coeur de porc avec en place le coenzyme (en rouge) et le lactate.
Les isoenzymes H₄ et H₃M₁ sont très efficaces pour catalyser la réaction dans le sens décrit ici.
Le pyruvate formé par oxydation du lactate peut entrer dans la mitochondrie où il subira une oxydation complète à condition que O₂ ne soit pas limitant (conditions aérobies).
Il constitue alors un métabolite respiratoire et les étapes intermédiaires de sa dégradation permettent le fonctionnement de la chaîne respiratoire, dont les transferts d'e^- sont couplés avec les phosphorylations oxydatives. Ainsi, une partie de l'énergie initialement présente dans le lactate est transférée dans l'ATP (voir schéma simplifié en haut de la page).