Culture en milieu liquide

de bactéries transformées

Production optimale

de

GFP fluorescente

-Choisir une colonie isolée qui émet une fluorescence verte quand elle est exposée aux UV (voir images ci-dessus).Cette colonie s'est développée sur le milieu gélosé "LB + ampicilline + arabinose". Les bactéries qui la constituent expriment les 3 gènes GFP, araC et bla portés par le plasmide pGLO, elles produisent la GFP fluorescente, la b lactamase responsable de la résistance à l'ampicilline et la protéine araC, facteur de régulation de l'expression du gène GFP, en relation avec le promoteur pBAD. L'arabinose du milieu interagit avec araC et induit l'expression du gène GFP.
Chaque cellule de la colonie est génétiquement identique (clone) à la bactérie fondatrice qui a été transformée avec le plasmide pGLO.
Il peut être intéressant de sélectionner également une colonie non fluorescente qui s'est développée sur une gélose" LB + amp" car elle comprend des bactéries transformées capables, si on leur fournit de l'arabinose, de synthétiser la GFP.
Pour une meilleure compréhension, voir TP1 "Transformation bactérienne".
- Ensemencer le milieu liquide "LB + ampicilline + arabinose" avec la colonie choisie
- Faire produire des molécules de GFP fluorescentes. Le milieu LB fournit les nutriments nécessaires pour une croissance bactérienne exponentielle, l'ampicilline sélectionne les cellules génétiquement modifiées, potentiellement capables de produire la GFP et l'arabinose induit la synthèse de la protéine d'intérêt. La température idéale est 32°C mais celle de la salle convient.
Il est indispensable de bien agiter régulièrement le tube car l'intervention de O₂ est indispensable pour que le fluorophore de la GFP devienne fonctionnel. En effet, après la traduction, une phase de maturation autocatalytique, conduit au réarrangement et à l'oxydation de la séquence Ser65-Tyr66-Gly67 avec mise en place d'une suite de liaisons conjuguées responsables de l'absorption des photons UV, suivie de la l'émission fluorescente. Si le tube n'est pas assez agité il peut y avoir production de GFP non fluorescente ce qui bloque l'expérimentation. Voir TP4.