Une électrophorèse pour contrôler la qualité
de la purification de la GFP
Pour contôler l'efficacité du processus de purification, on procède habituellement à une électrophorèse en gel de polyacrylamide, support qui ne peut être proposé aux élèves de lycée et qui sera donc remplacé par de l'agarose (moins efficace).
Electrophorèse
- gel agarose 4%, tampon Tris-Glycine-SDS
- échantillon"GFP" à tester: 10 µl d'éluat contenant la GFP, prélevés dans le tube de recueil 3, plus 10 µl de tampon de Laemmli (Tris-SDS, glycérol, bleu de bromophénol).
- échantillon "lysozyme" à tester: 5 µl de la solution de lysozyme utilisée pour la lyse des bactéries plus10 µl de tampon de Laemmli.
- dénaturation thermique des protéines présentes dans les échantillons: 5 min à 95°C.
- dépôts: 12 µl
- migration: 100 V, 45 min
- fixation du gel
- coloration par le bleu de Coomassie
Résultats
Piste 2 : essai tube de recueil 2, non concluant
Pistes 3, 4, 5 ,6 : différents tubes de recueil 3
Pistes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 : tube de recueil 3 à différentes concentrations
Image en négatif
Commentaires
Les gels obtenus sont difficiles à interpréter pour plusieurs raisons : discrimination insuffisante, absence de marqueur de masse moléculaire standard, conditions dénaturantes qui annulent la fluorescence de la GFP.
Dans tous les cas, l'électrophorégramme de l'éluat recueilli dans le tube 3 présente plusieurs bandes, la purification de la GFP n'est donc que partielle, d'autres protéines ont été retenues avec la protéine d'intérêt par le support chromatographique hydrophobe. La bande la plus éloignée du puits correspond au monomère du lysozyme (14,4 kD), celle du monomère de la GFPuv (28 kD) se trouve parmi les autres et pourrait correspondre à celle qui est repérée par une flèche.
L'exploitation des résultats reste limitée mais peut initier une discussion intéressante.
