Purification de la GFP

par chromatographie d'interaction hydrophobe

Le principe de la chromatographie d'interaction hydrophobe
Les protéines présentes dans un mélange sont séparées en fonction de leur plus ou moins importante "hydrophobicité" de surface. En effet, de nombreuses protéines hydrosolubles mises en présence d'un tampon de force ionique suffisante exposent des zones apolaires qui peuvent interagir avec des groupements chimiques hydrophobes du support chromatographique. Il faut donc choisir un tampon qui permet de lier la protéine d'intérêt à la matrice alors que les autres, moins hydrophobes sont entraînées.Il faut ensuite minimiser les interactions hydrophobes entre la protéine et la matrice pour l'entraîner à son tour et la récupérer.
Le support chromatographique est une matrice constituée de microscopiques billes (résine) recouvertes de groupements chimiques (phényle ou chaînes hydrogénocarbonées) apolaires donc hydrophobes. La matrice est placée dans une colonne (voir image ci-dessus).

L'HIC appliquée à la purification de la GFP : le protocole
La GFPuv présente dans le surnageant du lysat bactérien est globalement plus hydrophobe (moins hydrophile) que la plupart des autres protéines hydrosolubles exprimées par E.coli (voir TP4). Malgré les changements d'environnement, elle garde sa fluorescence durant toutes les étapes du protocole, ce qui permet de la repérer.

• Préparation de la colonne : équilibrer en versant 2 ml de tampon contenant 2NH₄⁺ SO₄^2-, 2M . Maintenir pendant 10 min.
• Application de l'échantillon et liaison des protéines dont la GFP à la matrice : voir détails et images.
• Lavage des protéines non recherchées : voir détails et images.
• Elution de la GFP : voir détails et images.