La structure tertiaire de la GFP

conditionne

maturation et fonctionnement du fluorophore

La manipulation des modèles moléculaires a, dans un premier temps, permis d'établir les principales caractéristiques de la configuration spatiale de la protéine. Structure chimique, maturation et fonctionnement du fluorophore ont également été abordés. Il s'agit maintenant de comprendre, par l'étude plus approfondie des modèles et par l'exploitation de données concernant les variants, l'importance de la stucture tertiaire de la GFP dans l'acquisition et le maintien des propriétés photophysiques de la molécule.
Quelques données intéressantes à exploiter
- La GFP est très résistante à la dénaturation thermique ou chimique, mais une fois dénaturée (par exemple après 5min à 95°C ), la fluorescence est perdue bien que fluorophore soit chimiquement intact.
- L'absence de plus de 7 résidus ac.aminés à l'une ou l'autre des extrémités de la protéine qui en comprend 238 entraîne la perte de la fluoresence.
- Le variant R96M a une vitesse de maturation très basse (cela peut demander plusieurs mois). La chaîne latérale de Met occupe à peu près le même volume que celle de Arg mais elle n'est pas chargée.
- Le variant E222G est caractérisé par la disparition de l'excitation à 395 nm (UV proche).
- La substitution de T203 par I ou le remplacement de H148 modifient les propriétés spectroscopiques de la protéine.
- Un analogue du chromophore qui a un spectre d'absorption proche de celui de la GFP en phase gazeuse, présente des bandes d'absorption différentes quand il est placé dans l'eau.
Informations tirées de l'étude des modèles moléculaires
Une exploration de l'environnement proche du fluorophore doit permettre de repérer les résidus ac.aminés qui peuvent interagir directement avec lui (liaisons ioniques, liaisons hydrogène, interaction hydrophobes...). On peut logiquement s'attendre à retrouver là certains des ac.aminés dont le remplacement modifie les propriétés spectrales de la GFP. Le voisinage du groupement phényl de Tyr 66 doit être l'objet d'une attention particulière à cause de son implication dans le mécanisme de l'émission fluorescente.

La représentation (image à gauche)est restreinte aux résidus ac. aminés ayant des atomes situés à moins de 0,5 nm du fluorophore (en vert). Une seule molécule d'eau a été conservée, elle se trouve dans une position stratégique.
On peut supposer que la plupart de ces ac.aminés participent à la stabilisation du fluorophore, certains étant impliqués dans sa maturation et /ou dans le processus d'absorption-émission.

Ainsi Arg 96 par sa charge + doit favoriser la cyclisation au cours de la maturation, His148, E222 (qui ont une chaîne latérale chargée) ou encore T203 (polaire) peuvent influer sur l'ionisation du groupement phényl de Tyr66, en particulier par l'intermédiaire de la molécule d'eau (liaisons hydrogène) et ainsi jouer un rôle dans le transfert de H+ impliqué dans le mécanisme de l'émission fluorescente.

Une nouvelle représentation (image à droite) sans V61, T62, T63, F64, V68, E69 (qui font partie de l'hélice a porteuse du fluorophore) montre que les autres résidus ac.aminés qui pointent leur chaîne latérale vers le fluorophore appartiennent à 7 brins b différents (et à une boucle).
Les données expérimentales indiquent que des résidus éloignés du fluorophore, situés aux deux extrémités de la chaîne protéique, influent sur la fluorescence de la GFP et que les propriétés spectrales du fluorophore sont modifiées par un contact direct avec le solvant (eau), contact qui ne peut se produire dans la protéine native. En effet, le fluorophore se retrouve au centre d'un édifice moléculaire très compact, sorte de cage formée par le feuillet b plissé et "fermée" aux extrémités par les boucles. (voir modèle complet).
Synthèse : C'est la configuration spatiale (déterminée par la stucture primaire) de la molécule de GFP dans son ensemble qui confère à la protéine l'aptitude à "fluorescer" par l'intermédiaire du fluorophore.