"Hydrophobicité" de la GFP


Interactions hydrophobes

La GFP recombinante extraite de E.coli est purifiée en TP par chromatographie d'interaction hydrophobe. Pour comprendre le principe de cette technique chromatoraphique, une approche moléculaire de la notion d'interaction hydrophobe est proposée à travers la manipulation d'un modèle de la GFP. Cette étude peut être l'occasion d'attirer l'attention des élèves sur le rôle déterminant que jouent les interactions hydrophobes dans le repliement d'une chaîne protéique lors de l'acquisition de sa structure tertiaire.

La GFP: une protéine fortement hydrophobe
La GFPuv exprimée dans la cellule de E coli est soluble mais elle est plus hydrophobe que la plupart des nombreuses protéines extraites avec elle du cytosol de la bactérie (voir TP 3). Comment peut-on expliquer le caractère fortement hydrophobe de la GFP?

  • Les informations tirées de l'étude d'un modèle moléculaire : la répartition des résidus hydrophobes et hydrophiles
Dans la représentation simple choisie ci-dessus, les résidus ac.aminés hydrophobes sont colorés en jaune, les autres, considérés comme hydrophiles, en gris-bleu, le fluorophore en vert, les molécules d'eau en rouge. A droite, la coloration des résidus hydrophiles est restreinte aux ac.aminés chargés (très hydrophiles). La molécule dans son ensemble apparaît constituée par des "amas" regroupant soit des résidus hydrophobes soit des résidus hydrophiles.
Les coupes révèlent que les groupement chimiques hydrophobes sont le plus souvent (mais pas toujours) enfouis dans la structure alors que les groupements hydrophiles sont plus nombreux en surface, en particulier ceux qui appartiennent à des ac.aminés chargés.

Les représentations ci-dessous montrent mieux la disposition relative des goupements hydrophobes et hydrophiles des résidus ac.aminés.Un des 11 brins b (séquence11-23) a été sélectionné. On visualise bien son squelette (répétition du motif Ca-CO-NH) et les chaînes latérales des résidus.
Les chaînes latérales hydrophobes sont majoritairement orientées vers l'intérieur matérialisé par le fluorophore,alors que les chaînes hydrophiles sont plutôt tournées vers l'extérieur donc en contact avec le solvant.
On peut proposer aux élèves de relever les ac.aminés que le logiciel (Chime, Rasmol....) considère comme hydrophobes ou hydrophiles (voir slab 55 ) et faire découvrir, par une étude comparative des molécules, comment les caractéristiques chimiques de la chaîne latérale déterminent la plus ou moins grande aptitude ou l'inaptitude à développer des liaisons hydrogène avec l'eau. Il est dès lors possible de comprendre l'intérêt que représente l'attribution d'un indice d'hydrophobie (ou d'hydrophilie) à chaque ac.aminé, pour évaluer l'hydrophobicité d'une séquence protéique car elle dépend certes du nombre relatif de résidus hydrophobes (ici 44%) mais aussi de leur nature (voir complément).
  • Les information tirées de l'analyse des profils "d'hydrophobicité" et "d'hydrophilicité"
Des logiciels sont conçus pour construire des tracés qui mettent en évidence les segments à caractère hydrophobe (courbe 1) ou hydrophile (courbe 2) d'une séquence protéique à partir des indices d'hydrophobie (hydropathie) et d'hydrophilie attribués à chaque résidu. Un profil d'accessibilité du solvant est également établi (courbe 3).
Le traitement de la séquence de la GFPuv isolée en TP par l'un de ces logiciels a permis d'obtenir les profils ci-dessous sur lesquels on a repéré le brins b (11-23) et l'hélice a interne qui porte le fluorophore.

La séquence de la GFPuv affiche une série de petites portions moyennement hydrophobes séparées par de courts segments non hydrophobes voire un peu hydrophiles.Cela correspond au tonneau b (voir modèle moléculaire ci-dessus) avec ses brins amphipathiques Les parties les plus hydrophobes concernent les extrémités de la séquence et l'hélice a interne qui porte le fluorophore. Globalement, la structure primaire suggère que la GFPuv doit être assez fortement hydrophobe mais la courbe 3 prévoit que plusieurs régions peuvent rester accessibles au solvant.

  • Synthèse
La séquence tend à faire de la GFPuv une protéine assez fortement hydrophobe mais si on considère la structure tertiaire, il faut nuancer car la plupart des chaînes latérales hydrophobes des ac.aminés qui constituent les brins du tonneau b (et les boucles) sont pointées vers le coeur de l'édifice moléculaire (où se trouve l'hélice a ) alors que les chaînes hydrophiles sont plutôt tournées vers la surface et exposées au solvant. Ainsi, chaque molécule de GFPuv, placée en milieu aqueux échange suffisamment de liaisons hydrogène (et ioniques) avec les molécules d'eau par l'intermédiaire de ses groupements polaires de surface (chargés ou non) pour se retrouver entourée par le solvant et séparée de ses semblables: la GFPuv est donc soluble (contrairement à la GFPwt qui, dans la cellule de E.coli, constitue des agrégats (inclusions).
L'importance des interactions hydrophobes dans l'acquisition de la structure tertiaire des protéines.
On rappellera simplement ici, à l'occasion de l'étude de l'hydrophobicité de la GFPuv, que l'effet hydrophobe est la force motrice du repliement des chaînes protéiques.