Mutations
et
propriétés nouvelles

du variant GFPuv purifié en TP

La Green Fluorescent Protein exprimée par la bactérie E. coli transformée (voir TP1) et purifiée par chromatographie d'interaction hydrophobe (TP3) est un variant codé par un gène modifié et inséré dans le plasmide pGLO. Le gène synthétique a été construit par ingéniérie moléculaire (DNA shuffling) dans le but d'obtenir une molécule plus intéressante (criblage des mutants) pour des applications de marquage en biologie cellulaire et moléculaire.
On propose d'essayer d'établir une relation entre mutations fixées dans le gène, structure et propriétés nouvelles du variant.
Les élèves disposent de la séquences du gène sauvage (fournie), de celle du gène qui code le variant (extraite du plamide pGLO, voir TP1), et des modèles moléculaires 1ema. pdb (GFP sauvage) et 1b9c.pdb (un variant proche de celui qui a été purifié) ainsi que de quelques données concernant les caractéristiques physico-chimiques du variant.

Le variant : une GFPuv très fluorescente et hydrosoluble
La GFP de type sauvage (GFPwt) peut être produite par E.coli mais les molécules forment alors le plus souvent des agrégats (inclusions) dans le cytoplasme et n'activent pas leur fluorophore. A l'origine, la GFP produite dans les photocytes de la méduse Aequorea victoria, est excitée par l'intermédiaire d'une autre protéine l'aequorine avec laquelle elle est liée par des interactions hydrophobes. L'aequorine stimulée par Ca2+ émet dans le bleu spectral (470 nm) des photons absorbés par la GFP qui peut alors "fluorescer". Quand la protéine est exprimée dans la cellule de E.coli, il n'y a pas d'aequorine et les molécules de GFP sauvage s'assemblent probablement par les sites hydrophobes alors libres, elles sont alors peu ou pas fluorescentes.

"Notre" variant est hydrosoluble, il a un spectre d'absorption avec les mêmes bandes à 385 nm et 480 nm (voir courbe) que la GFPwt mais le maximum dans l'UV proche est beaucoup plus marqué alors que celui situé dans le bleu spectral est très peu marqué. Le variant est une GFPuv qui" fluoresce" intensément (505 nm-508 nm) dans les cellules vivantes lorsqu'on la stimule à 380 nm.

Les mutations fixées dans le gène qui code la GFPuv

Le traitement conjoint des séquences du gène initial et de la version mutée extraite du plasmide pGLO permet d'obtenir les séquences respectives des protéines codées, de repérer les mutations introduites et leur conséquences sur la structure primaire de la GFPuv. On relève 30 mutations dans le gène synthétique:
- une insertion d'un triplet qui code Ala en position 2 (juste après le codon initiateur).
- 18 mutations ponctuelles par substitution, silencieuses.
- 7 mutations par substitution de 2 nucléotides, silencieuses, dont 5 qui concernent le triplet AGA, codant Arg, changé en CGC ou CGT.
- 4 mutations ponctuelles par substitution, faux-sens, à l'origine des changements suivants : Gln81Arg, Phe100 Ser, Met154Thr,Val164Ala.

Les changements induits par les mutations repérés sur un modèle 3D de la GFPuv

Le modèle moléculaire utilisé correspond à une GFPuv qui n'est pas exactement celle qui est codée par le gène intégré au plasmide pGLO, mais elle en est très proche. On peut repérer les résidus changés par rapport à la GFPwt : Ser100 à la place de Phe, Thr154 à la place de Met, Ala164 à la place de Val.
On voit que dans ce variant, Gln81 est conservé. Ala 2 ne peut être visualisé car il manque ici les premiers résidus.
La configuration tridimensionnelle de la GFPuv est identique à celle de la GFPwt (étudiée par ailleurs).
Les résidus changés sont en surface avec notamment les chaînes latérales de Ser100, Thr154 et probablement Arg81 directement exposée au solvant, seule celle de Ala164 est tournée vers l'intérieur.

Les relations entre structure et caractéristiques physico-chimiques du variant GFPuv
- Chacun des 4 résidus nouveaux est plus hydrophile que celui qu'il remplace et pour les substitutions F100S et M154T, il y a un ac.aminé hydrophile à la place d'un ac. aminé hydrophobe. De plus, les chaînes latérales de S100, T154, R81 sont en contact direct avec le solvant. On peut donc penser que les substitutions modifient les interactions hydrophobes / hydrophiles entre la molécule et le solvant dans le sens d'une augmentation d'hydrosolubilité, les sites incriminés plus hydrophobes dans la molécule naturelle pouvant servir de points d'ancrage lors de la formation des agrégats. La plus grande hydrosolubilité du variant serait indirectement à l'origine de l'augmentation de l'intensité de la fluorescence.
- Les mutations silencieuses qui affectent le triplet AGA changé en CGC ou CGT (brin non transcrit de l'ADN) optimisent le codon pour E.coli car AGA est très peu utilisé par la bactérie par rapport aux 2 autres.