Spectres d'absorption UV de l'ADN, d'une protéine

Signification du rapport A260/A280

La spectroscopie UV ne donne que peu de renseignements sur la structure chimique des molécules, c'est surtout un outil d'analyse quantitative. Ici, il s'agit de justifier l'utilisation du rapport A260/A280 utilisé pour évaluer la pureté des extraits d'ADN que l'on veut, par exemple, soumettre à la PCR.
Pour cela, des spectres d'absorption sont réalisés, en UV proche, avec des échantillons d'ADN, de sérum albumine bovine (protéine), de nucléotides (constituants de l'ADN) et de tyrosine (un des 20 ac. aminés entrant dans la constitution des protéines) en solution dans l'eau.
La cuve de référence contient donc de l'eau (c'est le "blanc").
Spectre d'un échantillon d'ADN
Survolez l'image ci-dessus avec la souris pour afficher le spectre des nucléotides libres.
Le spectre d'absorption de l'échantillon d'ADN met en évidence une large bande d'absorption dans l'UV proche, avec un maximum pour l = 260 nm. On retrouve cette bande( image survolée) avec plusieurs épaulements dans le spectre des nucléotides libres, précurseurs associés (sous leur forme monophosphate) dans la molécule d'ADN. Les épaulements correspondent aux maximuns d'absorption, un peu différents les uns des autres, des chromophores que sont les bases azotées des nucléotides : Adénine, Guanine, Cytosine, Thymine. Les épaulements sont fusionnés lorsque la concentration des nucléotides est plus faible (image de droite) et dans le cas de l'ADN.
Les bases azotées absorbent intensément vers 260 nm car la molécule de chacune d'entre-elles présente un hétérocycle, système fortement conjugué, les doublets libres des hétéroatomes pouvant participer à la délocalisation des électrons.
Il y a également une intense absorption vers 200-190 nm mais elle n'est pas caractéristique car dans cette région du spectre, la plupart des molécules organiques présentent des pics, parfois nombreux.
Rq/ Le mélange de nucléotides utilisé a, en réalité, été préparé pour une PCR et pour diverses raisons, un colorant jaune (tartrazine) a été ajouté à la solution .
Le spectre d'absorption du mélange (voir image survolée) affiche une très large bande d'absorption avec un maximum, dans le visible, pour l = 425 nm.
La tartrazine présente un système conjugué très élargi (plusieurs chromophores), responsable du déplacement de l'absorption dans le visible et à l'origine de sa couleur.
Spectre d'absorption d'une protéine (sérum albumine bovine ou SAB)
La SAB, incolore en solution dans l'eau (comme l'ADN) n'absorbe pas dans le visible. Son spectre présente une large bande d'absorption dans l'UV proche avec un maximum, ici pour l = 278 nm. Les pics correspondant à des énergies plus grandes (l plus petites) ne sont pas caractéristiques des protéines.
La structure primaire des protéines correspond à un enchaînement d'acides aminés réliés entre eux par la liaison peptidique. Les cellules utilisent 20 amino-acides différents (dont la tyrosine)pour construire leurs protéines.
Le spectre de la tyrosine montre que cet ac.aminé présente une bande d'absorption avec un maximum pour l = 278 nm. L'intense absorption est due à la présence du système conjugué du cycle phénolique dans la molécule de Tyr. Deux autres acides aminés (non testés ici), également aromatiques présentent un système conjugué qui leur confère l'aptitude à absorber au voisinage de 280 nm, il s'agit du tryptophane Trp (max. à 280 nm) et de la phénylalanine Phe (max. à 257 nm).
Dans les conditions de mesure ( pH voisin de 7), c'est surtout la tyrosine qui est responsable de l'absorbance vers 280 nm. En effet, dans la molécule de SAB, les résidus Tyr représentent 31% de l'ensemble, Phe, un peu plus et Trp, seulement 0,3% (voir séquence). A leur maximum d'absorption respectif, c'est la molécule de Trp qui absorbe le plus intensément, environ 4 fois plus que celle de Tyr, alors que celle de Phe absorbe beaucoup moins ( environ 28 fois moins). Concernant A280 la prise en compte des deux paramètres (nombe de résidus, importance de l'absorbance), fait du système conjugué de Tyr, le chromophore le plus efficace dans le cas de la SAB. C'est souvent le cas pour les autres protéines.
Rq/ La liaison peptidique a une intense absorbance vers 180 nm.
Rq/ La petite portion de molécule modélisée sur l'image ci-dessus est encadrée sur celle de la séquence.
Signification du rapport A260 / A280
- A260 est le maximum d'absorption de l'ADN. Dans certaines limites, cette absorbance est proportionnelle à la concentration en ADN.
- l'ADN absorbe environ 2 fois moins à 280 nm qu'à 260 nm.
- A280 est le maximum d'absorption des protéines. Dans certaines limites, cette absorbance est proportionnelle à la concentration en protéine(s).
Quand on réalise un extrait cellulaire d'ADN, il est accompagné par des protéines dont la présence peut être indésirable. La valeur du rapport A260/A280 fournit une bonne indication sur la pureté de l'échantillon. En effet, la présence de protéines fait augmenter A280.
On a établi qu'un rapport, mesuré par spectroscopie, d'une valeur comprise entre 2 et 1,8 indique que l'ADN extrait est pur alors que si il est inférieur, on peut envisager une contamination par des protéines.
Une valeur supérieure à 2 indique, en général, une présence importante d'ARN.
Le rapport A260/A280 pour l'échantillon d'ADN étudié, déterminé d'après les spectres ci-dessus est égal à 1,4/08 soit 1,75. L'ADNest faiblement contaminé par des protéines.