• Objectifs
  

Vérifier les acquis concernant les notions de site actif, complexe enzyme-substrat, cinétique enzymatique, par l'étude expérimentale (EXAO) d'une inhibition compétitive. L'enzyme choisie ,
la béta-galactosidase de Escherichia coli, par ailleurs très souvent utilisée en biologie moléculaire
(voir autre TP proposé) catalyse l'hydrolyse des b-galactosides en particulier le lactose.

• Principe

Utiliser un substrat, l'ONPG, dont l'hydrolyse, catalysée par la b-galactosidase, conduit à la formation d'un produit coloré (jaune) dont on peut suivre l'apparition
en colorimétrie par l'intermédiaire d'une chaîne EXAO. Faire varier la concentration
en substrat pour obtenir dans un premier temps la courbe Vi= f(S) puis recommencer en présence de l'inhibiteur.

• Données biochimiques

Des données indispensables pour comprendre le protocole et les résultats obtenus sont fournies aux élèves, ells concernent les acteurs moléculaires impliqués et la réaction étudiée.

• Protocole expérimental

-Dispositif EXAO avec spectro calé sur l= 410 nm. Logiciel Enzymo (Jeulin)
-Pour obtenir Vi= f(S) en absence de l'inhibiteur, faire le 0 d'absorbance sur la cuve de référence (blanc) avec 2 ml tampon phosphate 0,1M pH=7,4 + 0,1ml de mercaptoéthanol 3,4M + 0,1ml de
Mg Cl2 à 0,03M + 0,1ml d'enzyme.Déclencher la réaction en ajoutant 0,1ml d'ONPG à 0,75 g/l ou à 3g/l ou à 9g/ l...Enregistrer chaque cinétique pendant 1 min.
-Pour obtenir Vi= f(S) en présence de l'inhibiteur (thiodigalactoside), procéder de la même façon mais ajouter dans chaque cuve 0,1ml de thiodigalactoside 0,1M et utiliser 1, 9 ml de tampon.

• Résultats

-Animation
-Vi= f(S) avec les cinétiques P= f(t) en absence d'inhibiteur
-Vi= f(S) avec les cinétiques P= f(t) en présence d'inhibiteur
-Vi= f(S) avec et sans inhibiteur.