La cytométrie en flux
pour suivre
le cycle cellulaire

-Culture et préparation des cellules
-Fonctionnement du cytomètre
-Animation

La cytométrie en flux est une technique qui permet de mesurer certains paramètres (taille, granularité...) de cellules entraînées rapidement dans une gaine liquide et amenées une par une dans un faisceau laser. Pour l'étude du cycle cellulaire, on exploite l'aptitude de la cellule à émettre lors de son passage dans le faisceau laser diverses fluorescences par excitation de fluorochromes fixés directement ou indirectement sur l'ADN. Les mesures sont effectuées très rapidement, en général, plusieurs milliers de cellules sont analysées à la seconde.

Culture et préparation des cellules

  • Culture des cellules en présence de BrdU
    Les cellules sont mises en culture en présence de Brdu (bromodéoxyuridine) pendant un temps relativement court (30 min) par rapport à la durée de la phase S. Les cellules en cours de phase S incorporent la Brdu à la place de la thymidine, dans l'ADN néosynthétisé.
  • Transfert des cellules sur milieu sans BrdU, culture, prélèvement d'un échantillon toutes les heures
    Après exposition à la Brdu, les cellules sont transférées puis cultivées dans un milieu sans Brdu. Un échantillon est prélevé toutes les heures, les cellules récupérées sont ensuite traitées afin d'être analysées dans le cytomètre.
  • Marquage de la Brdu et de l'ADN par les fluorochromes
    Les cellules de chaque échantillon sont mises en présence de 2 marqueurs, d'une part un anticorps anti-BrdU associé au fluorochrome FITC (Fluorescein IsoThioCyanate) et d' autre part le fluorochrome PI (Iodure de Propidium) qui lui s'intercale entre les bases de la double hélice de la molécule d'ADN.

Fonctionnement du cytomètre en flux
Les explications ne concernent que les mesures des paramètres nécessaires pour l'étude du cycle cellulaire. Il ne sera donc pas question ici des signaux qui permettent d'étudier la taille et la granularité des cellules bien que les données concernant ces signaux soient disponibles FSC et SSC) et que leur exploitation puisse être intéressante (homogénéité des populations, débris cellulaires, agrégats...).

  • Les cellules d'un échantillon, en file indienne, sont guidées dans un flux liquide vers un faisceau laser.
  • Les fluorochromes présents dans chaque cellule, sont excités par la lumière incidente et émettent à leur tour une lumière dite de fluorescence. Ici on peut utiliser un laser à ions d'argon qui émet dans le bleu spectral (l = 488nm) , la lumière incidente est alors bien absorbée par les 2 fluorochromes, FITC réémettant dans le vert et PI dans le rouge du spectre.
  • Les signaux optiques émis par fluorescence sont séparés (miroirs dichroïques) puis transmis vers des détecteurs.On peut dans un premier temps considérer que la quantité de lumière émise par FITC est proportionnelle à la quantité de Brdu incorporée (pendant l'incubation en présence de BrdU) dans l'ADN de la cellule analysée et que la quantité de lumière émise par PI est , elle, proportionnelle à la quantité d'ADN présente au temps t de prélèvement final.
  • Les détecteurs (ici FL pour Fluorescence Light) convertissent et amplifient les signaux optiques en signaux électriques d'amplitude proportionnelle à la quantité de lumière reçue (signaux analogiques entre 0 et 10 V).
  • Les signaux électriques analogiques sont ensuite convertis en signaux numériques compris entre 0 et 1023 pour un convertisseur 10 bits.

L'analyse par cytométrie en flux fournit pour chaque cellule 2 valeurs qui permettent de mesurer indirectement, l'une la quantité de BRdU et l'autre la quantité d'ADN présentes dans cette cellule au moment de son prélèvement.