protocole


		Transformation bactérienne Protocole expérimental
	Chaque groupe d'élèves dispose d'une "culture-mère" de E.coli sensible à l'ampicilline, de 4 boîtes de pétri à ensemencer préparées avec une gélose nutritive LB (+ IPTG), dont 3 contenant de l'ampicilline. Des pipettes et ensemenceurs stériles, la solution de plasmide pGF, celle du plasmide pBF et la solution de transformation ( CaCl₂) sont également fournis aux élèves. Il faut prévoir de la glace et un bain chauffé à 42°C . Les élèves travaillent en atmosphère stérile (même si ce n'est pas indispensable pour l'obtention de résultats corrects) et suivent les consignes de sécurité d'usage. Le protocole n'est pas ici décrit en détail, seules les principales étapes sont mentionnées.

			- Transformation Les bactéries (une ou deux colonies) prélevées dans la "culture-mère" sont placées en suspension dans la solution de transformation soit en présence de pBF soit en présence de pGF. Elles sont ensuite soumises à un choc thermique par passage brutal glace-bain à 42°C pendant 90s-glace. Les 2 traitements (chimique et thermique) conjugués facilitent l'entrée du plasmide dans la cellule bactérienne (avec un faible rendement). Un échantillon témoin de E.coli (une colonie) est préparé de la même façon mais sans plasmide. - Encemensement Les bactéries ainsi préparées sont utilisées pour ensemencer méthodiquement par étalement les différents milieux pré-coulés de manière à obtenir 4 types de cultures: - LB / IPTG avec E.coli sans plasmide (n°1) - LB / IPTG / amp avec E.coli sans plasmide (n°2) - LB / IPTG / amp avec E.coli + pFG (n°3) - LB / IPTG / amp avec E.coli + pFB (n°4) - Croissance Les boîtes ensemencées sont placées à 37°C pendant 24 h. - Visualisation des résultats Les boîtes sont observées puis placées sous une lampe UV.
Rq/ Au lycée, il n'est peut-être pas nécessaire de mentionner la présence de l'IPTG, inducteur indispensable au bon fontionnement du système d'expression du transgène codant la protéine fluorescente dans la bactérie transformée.