Green Fluoro Protein

Blue Fluoro Protein

Transformation

bactérienne

TP lycée

L'expérimentation est une variante de celle qui est présentée par ailleurs (voir TP1) dans laquelle le vecteur des transgènes est le plasmide pGLO (kit Bio-Rad) alors qu'ici 2 autres plasmides sont utilisés (kit Edvotek) pFluorogreen et pFluoroblue. Le premier contient le gène qui code la Green Fluoro Protein (GFP) alors que le second contient celui qui code la Blue Fluoro Protein (BFP), un variant de la GFP.
Autres TP associés au thème "transformation bactérienne /GFP"
- Digestion du plasmide pGLO (vecteur de la transgenèse) par des enzymes de restriction: (voir TP2 )
- Purification de la GFP produite par des bactéries transformées: (voir TP3)
- Structure et caractéristiques physico-chimiques de la GFP: (voir TP4).

Place de l'expérimentation dans une démarche pédagogique

L'expérimentation a été réalisée par des élèves de TemS Spé.SVT dans le cadre du thème sur les biotechnologies. Elle permet une approche pratique d'une technique largement utilisée en biologie moléculaire et à la base de l'obtention des OGM: la transgenèse. Le transgène ciblé ici est souvent utilisé comme gène rapporteur, dans les expériences de transgenèse, à cause de la fluorescence de la protéine codée (GFP ou BFP). La manip peut servir de support pour entrevoir quelles sont les applications possibles d'une telle technologie et quels sont les problèmes posés par sa mise en oeuvre (partie non traitée ici).
L'expérimentation est également intéressante pour l'approche d'autres notions : l'ADN suppport de l'information génétique; universalité du code génétique; expression des gènes; relations entre information génétique, protéine et phénotype cellulaire; résistance bactérienne aux antibiotiques... mais il n'est pas question de la proposer en classe de seconde.

Principe de l'expérimentation
Utiliser deux versions d'un plasmide vecteur pour transformer des bactéries (E. coli) et leur transmettre l'aptitude à résister à l'ampicilline et à produire une protéine fluorescente en UV. Les deux plasmides sont identiques sauf en ce qui concerne le transgène d'intérêt. L'un contient le gène qui code la Green Fluorescent Protein (GFP) isolé, à l'origine, du génome d'une méduse (Aequorea victoria) alors que l'autre contient une version modifiée de ce gène qui code la Blue Fluorescent Protein (GFP). La GFP donne une fluorescence verte en UV alors que la BFP émet une fluorescence bleue.
Sélectionner les bactéries transformées par culture sur un milieu approprié (avec ampicilline) et vérifier par exposition aux UV qu'elles présentent bien le phénotype attendu.

Compléments
- Cartes des plasmides, vecteurs de la transgenèse : voir images
- Système d'expression du transgène GFP (ou BFP) dans la bactérie hôte: voir modèles

Etapes de l'étude, quelques pistes pour compléter l'expérimentation
- Manipulation transformation bactérienne : voir protocole
- Résultats : voir images et commentaires
- Identification dans les plasmides des séquences des transgènes et repérage du promoteur T7 ARN polymérase (Anagène + modèles moléculaires) : voir résultats
- Localisation précise sur la carte du plasmide pFG des séquences repérées (gènes et promoteurs) : voir résultats
- Relation entre structure de la protéine et couleur de la fluorescence (modèles moléculaires) : voir résultats
- Etablissement de relations entre information génétique, protéines et phénotype cellulaire (synthèse) : voir résultats

Commentaire
L'expérimentation est très intéressante et motivante pour des élèves de lycée (1èreS ou TS spé). Elle peut être proposée à des élèves bien préparés, en effectif réduit (groupe), à condition qu'ils soient capables de suivre à la lettre les consignes de sécurité permettant d'empêcher toute contamination des personnes et de l'environnement. Il ne me paraît pas raisonnable de la programmer en classe de seconde.
Auteur, professeur de SVT : Auclair Jean Jacques
Les pages ne sont libres de droits qu'à la condition d'être utilisées dans le cadre d'une classe.