GFP et BFP

Relation entre structure de la protéine et couleur de la fluorescence

Le gène plasmidique qui code la BFP est un variant, obtenu par mutagenèse dirigée, de celui qui code la GFP. Les 2 séquences ne diffèrent que par 2 nucléotides et les mutations créees ont pour conséquence les remplacements suivants Tyr 66 His et Tyr 145 Phe, dans la protéine.
Comment le changement de ces 2 ac. aminés (sur les 238 que comporte la molécule) peut-il être à l'origine d'une modification de couleur de la fluorescence de la protéine?
Données fournies par l'étude préalable "Relations entre structure de la GFP et fluorescence": voir autre TP
Le fluorophore de la GFP est constitué par une courte séquence de 3 résidus ac.aminés Ser 65, Tyr 66 et Gly 67 qui subit une réorganisation autocatalytique post-traductionnelle avec mise en place d'un système conjugué (électrons délocalisés) étendu (intégrant l'hydroxyle de Tyr 66). Ce système se retrouve au centre de la molécule (de forme cylindrique), intégré à une hélice a. Il est directement responsable de l'absorption en UV suivie de l'émission (fluorescence) dans le vert spectral. Il a cependant été établi que plusieurs résidus ac. aminés situés à proximité du fluorophore ont également un rôle déterminant et on peut même considérer que c'est la configuration spatiale (déterminée par la structure primaire) de la molécule dans son ensemble qui confère à la protéine son aptitude à "fluorescer" par l'intermédiaire du fluorophore.

Informations tirées de l'étude comparative des modèles moléculaires de la GFP et de la BFP

La configuration spatiale des 2 protéines est très proche. Le remplacement de Tyr 66 par His affecte le fluorophore lui-même mais celui-ci reste capable d'absorber dans l'UV proche et d'émettre dans le visible. Il peut être intéressant de localiser spatialement l'autre changement Tyr145 Phe par rapport au fluorophore. Voir ci-dessous.
Le résidu ac. aminé 145 est situé dans l'environnement proche du fluorophore (moins de 0,5 nm). Il est peut-être impliqué (avec d'autres ac. aminés) dans des interactions (indirectes?) avec le fluorophore qui interviennent dans le processus d'excitation-émission. La substitution Tyr 145 Phe peut modifier les interactions.
C'est le système conjugué étendu du fluorophore qui est directement responsable de l'absorption des photons UV (proche) suivie de l'émission dans le visible, il est modifié par le remplacement Tyr 66 His (voir ci-dessous).
Dans le variant BFP de la GFP, le remplacement de 2 ac. aminés conduit à une modification du système conjugué du fluorophore et à un changement de ses interactions avec son environnement immédiat, cela a pour conséquence un déplacement du maximum d'absorption et du pic d'émission vers les longueurs d'onde un peu plus courtes. Ainsi l'absorption des photons produits par une lampe UV appropriée génère une fluorescence verte pour la GFP et bleue (moins intense) pour la BFP.
Exposez les molécules aux UV en survolant l'image avec la souris.