Principe de l'immunoélectrophorèse

 

Principales étapes du protocole

Principe
Dans un premier temps, les protéines sériques sont séparées par électrophorèse. Ensuite les fractions obtenues sont étudiées avec des anticorps spécifiques des protéines sériques par la méthode de la double diffusion.

Principales étapes du protocole
  • Electrophorèse

- Dépôt des sérums
2 µl de sérum de contrôle dans les puits marqués C et 2 µl de sérum du patient dans les puits marqués P.
- Migration
Plaque d'agarose placée dans la cuve ( préchargée en tampon à pH 8,5), puits du côté cathode. Tension de 100V appliquée pendant 45 mn.
Les protéines qui ont une charge globale négative sont séparées essentiellement en fonction de cette charge, leur taille et le courant d'électro-endosmose intervenant également.
- Résultats
Les fractions albumine, a1, a2, b, et g globulines sont séparées comme dans une électrophorèse de zone classique mais ici on ne les visualise pas par coloration.
  • Immunodiffusion
Les immuns sérums utilisés ont été préparés à partir de sérums de chèvre ou de mouton: antisérum contre sérum total humain, antisérum contre les IgG humaines (anti g), antisérum contre les IgA humaines (anti a), antisérum contre les IgM humaines (anti µ), antisérum contre les chaînes légères Kappa (k), antisérum contre les chaînes légères l et antisérum trivalent contre les IgG, les IgA et les IgM humaines.

- Dépôt des antisérums
20 µl de l'antisérum approprié poly ou monospécifique dans chaque rigole parallèle à l'axe de migration.
- Double diffusion
Gel placé dans une chambre humide et incubé à 20°C pendant 18h.
Les protéines sériques (Ag) et les anticorps diffusent librement dans le support. Des complexes immuns se forment dans la zone d'équivalence (réseau) où il y a précipitation.
-Lavage et coloration
Elimination par lavage-absorption (NaCl 0,85%) des protéines restées libres puis séchage des plaques et coloration à l'aide d'un colorant bleu pour protéines.
Décoloration puis séchage.
Seuls les arcs de précipitation apparaissent colorés.